摘要gydF4y2Ba
肺泡是由鳞状肺泡型(at1)细胞和分泌表面活性剂的立方型AT2细胞组成的气体交换囊。经典研究认为AT1起源于AT2细胞，但最近的研究提出了其他来源。在这里，我们使用分子标记，谱系追踪和克隆分析绘制整个小鼠寿命的肺泡祖细胞。我们发现，在发育过程中，AT1和AT2细胞直接产生于双性祖细胞，而出生后新的AT1细胞来自罕见的、自我更新的、长寿的、成熟的AT2细胞，这些细胞产生缓慢扩张的肺泡更新克隆灶。这种干细胞功能被AT1损伤广泛激活，而AT2的自我更新是由EGFR(表皮生长因子受体)配体选择性诱导的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和致癌gydF4y2BaKras(G12D)在体内gydF4y2Ba，有效地生成多灶性克隆腺瘤。因此，出生后会有一个转换，当AT2细胞作为干细胞作用时，有助于肺泡更新、修复和癌症。我们提出局部信号调节AT2干细胞活性:一个由EGFR-KRAS转导的信号控制自我更新并在肿瘤发生过程中被劫持，而另一个信号控制AT1命运的重编程。gydF4y2Ba
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确认gydF4y2Ba
我们感谢A. Andalon提供的技术援助;H. Chapman (SftpC-Cre-ER-rtTA)， B. Hogan (CCSP-Cre-ER)， H. Ueno和I. Weissman (Rainbow)， H. Clevers (Confetti)， L. Luo (mTmG)和J. Sage (KrasgydF4y2BaLSL-G12DgydF4y2Ba)用于菌株;B.山羊抗ccsp抗体条带;F. H. Espinoza的注释基因列表;R. Metzger, H. Chapman和Krasnow实验室的成员对手稿进行讨论和评论;玛丽亚·彼得森帮助准备数据和手稿。gydF4y2Ba
作者信息gydF4y2Ba
从属关系gydF4y2Ba
贡献gydF4y2Ba
除了由D.G.B.完成的基因表达谱和AT2细胞培养外，T.J.D.进行了其他实验;tj.d.， D.G.B.和M.A.K.构想了实验，分析了数据并撰写了手稿。这项工作得到了Parker B. Francis基金会奖学金和NIH 5KO8HL084095奖(T.J.D.)， NIH T32HD007249 (D.G.B.)和NHLBI U01HL099995祖细胞生物学联盟资助(M.A.K.)的支持。M.A.K.是霍华德休斯医学研究所的研究员。gydF4y2Ba
相应的作者gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
相互竞争的利益gydF4y2Ba
作者声明没有相互竞争的经济利益。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
图1肺和肺泡成熟发育的结构。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，成熟肺显示近距离(插图)从支气管到肺泡的过渡gydF4y2Bahttp://www.mayoclinic.com/gydF4y2Ba，经允许)。gydF4y2BabgydF4y2Ba肺泡被密集的毛细血管网包围，其中来自肺动脉的缺氧血(蓝色)被氧合(红色)，然后通过肺静脉回流到心脏(修改自参考文献。gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)．gydF4y2BacgydF4y2BaE16.5 sh - cre > mTmG小鼠肺，其中GFP在整个上皮细胞中表达。叶瓣标记(RAcc，右附件;RCr，右颅;RMid，右中间;RCa，右尾侧;左)和方框区域显示用于发育分析的副瓣尖端。E16.5时，支气管树形成，1天后，扁平(鳞状)AT1细胞和立方状AT2细胞成熟，形成功能气体交换界面，囊泡开始形成。囊泡随后进行细分(“二次分离”)，形成成熟的肺泡，提供广泛的气体交换表面。比例尺，1毫米;gydF4y2BadgydF4y2Ba，囊形成过程中的细胞形态发生示意图(摘自参考文献。gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)．祖细胞在毛细血管附近形成扁平的AT1细胞，AT2细胞专门分泌表面活性剂。gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba,gydF4y2Bae”gydF4y2Ba,gydF4y2Baf 'gydF4y2Ba、原理图(gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba)及图像(gydF4y2Bae”gydF4y2Ba,gydF4y2Baf 'gydF4y2Bae -cadherin染色副叶尖端在E18.5和出生后第2天(PN2)显示纵向(gydF4y2BaegydF4y2Ba)和正面(gydF4y2BafgydF4y2Ba)成熟AT1(1)及AT2(2)细胞的图示。P,近端;D,远端;红色，细胞连接(jxn);黄色，顶端表面。可见囊状气道远端缺少AT1细胞。比例尺，10 μm (gydF4y2Bae”gydF4y2Ba,gydF4y2Baf 'gydF4y2Ba)．gydF4y2BaggydF4y2Ba， E18.3肺中囊状气道细胞类型超微结构分类的量化(见gydF4y2Ba图1你gydF4y2Ba)．所示值为每个祖细胞和细胞类型的数量，并观察到相应的超微结构特征。没有细胞(gydF4y2BangydF4y2Ba= 36)具有AT2> AT1中间细胞(AT1/2)或成熟AT2细胞的特征。E，胚胎日;PN，产后日。gydF4y2Ba
图2肺泡祖细胞克隆分析及用LysM-Cre标记和示踪肺泡2型(AT2)细胞谱系gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2BaShh-Cre-ER > mTmG胚胎在子宫内用E15时有限剂量(2 mg)他莫昔芬(他莫昔芬)诱导到远端肺尖的脉冲标记上皮细胞(肺泡祖细胞)，在分化开始前不久用GFP(每个胚胎肺叶0.2个标记细胞)，然后在34天后PN30时检查。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，在PN30肺中表达GFP谱系标记(绿色)的分离克隆(虚线圈)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，肺泡克隆体内的盒状区域特写显示几个扁平的AT1细胞(打开的箭头)和一个立方体的AT2细胞(填充的箭头)，表明标记的祖细胞是双性的。标记的细胞中散布着未重组的细胞(tdTomato，红色)。E，胚胎日;PN，产后日;比例尺，50 μm。gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba，肺泡特写1 (gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba)及2个月大(gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2BaLysM-Cre > mTmG肺AT2谱系标记(GFP，绿色)和AT2 (gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba)或AT1 (gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba)标记指示。注意，在1个月时谱系标记细胞(绿色)表达AT2 (gydF4y2BacgydF4y2Ba)，而不是AT1标记(gydF4y2BaegydF4y2Ba)．两个月大时(gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba)，在一些扁平的AT1细胞中也观察到谱系标记。填充箭头，AT2细胞;开箭头，AT1细胞;E，胚胎日;PN，产后日。比例尺，20 μm (gydF4y2BacgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
图3双能祖细胞和肺泡上皮细胞增殖分析。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba妊娠晚期(E17.5;gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和产后早期(PN7, 14, 21;gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba)肺中Nkx2.1(绿色)为上皮细胞，Ki67(红色)为活跃循环细胞。注意本质上的排他性标记，表明双能祖细胞增殖极少(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或AT1及AT2细胞(gydF4y2BabgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba)．箭，一个罕见的增殖AT2细胞。横线勾勒出远端上皮尖端;虚线为间皮。E，胚胎日;PN，产后日;比例尺，35 μm。gydF4y2Ba
图4 LysM-Cre和sftpc - cre标记细胞的细胞类型标记和长期谱系贡献的量化gydF4y2Ba
一个gydF4y2Bapn3个月(mo) sh - cre > R26EYFP小鼠肺肺泡区共染色GFP(绿色，上皮细胞质)和LysM(红色)。插图显示了被装箱区域的特写。许多AT2细胞的细胞质中检测到LysM(填充箭头)，但AT1细胞的细胞质中检测不到LysM(开箭头)。gydF4y2BabgydF4y2Ba在pn2 mo LysM报告鼠的支气管肺泡肺区进行E-cadherin(红色)染色，标记气道上皮，GFP(绿色)标记表达LysM的细胞。注意AT2(填充箭头)，而细支气管细胞(虚线标记支气管肺泡交界处(Badj))不表达LysM报告基因。gydF4y2BacgydF4y2Bapn17 mo LysM-Cre > mTmG肺E-cadherin(红色)和AT2谱系标记物(绿色)染色。可见终支细支气管中有许多标记的AT2细胞(填充箭头)，但没有谱系标记的细胞(虚线，Badj)。gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba，肺来自LysM-EGFP (gydF4y2BadgydF4y2Ba)和LysM-Cre > mTmG (gydF4y2BaegydF4y2Ba)在相应年龄的纤毛(乙酰化微管蛋白，acTub，红色)和神经内分泌(NE)细胞(CGRP，蓝色)标记和GFP(绿色)染色的小鼠中没有共表达细胞，表明纤毛(填充箭头)和NE(开放箭头)细胞类型不表达LysM，也不来源于AT2细胞。Br,支气管。gydF4y2BafgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba从相应年龄的LysM-Cre > mTmG小鼠的肺中，AT2谱系标记(绿色)、AT2细胞标记SftpC(红色)和Clara细胞标记CCSP(蓝色)染色显示CCSPgydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ SftpCgydF4y2Ba+gydF4y2Ba(双阳性)细胞(*)在Badj，其中一些被标记。标记的双阳性细胞是孤立的(gydF4y2BaggydF4y2Ba)或连体(gydF4y2BahgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba我gydF4y2Ba对pn1个月的SftpC-Cre-ER > mTmG小鼠(PN19给药1 mg他莫西芬)的肺进行脉象标记后13天分析，并染色gydF4y2BadgydF4y2Ba．注意没有共表达细胞，这表明纤毛细胞(填充箭头)和NE细胞(开放箭头)类型没有被标记。gydF4y2BajgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba，小鼠的肺被标记为在面板中gydF4y2Ba我gydF4y2Ba分析了13天(gydF4y2BajgydF4y2Ba)及192天(gydF4y2BakgydF4y2Ba,gydF4y2BalgydF4y2Ba)后来，染成了gydF4y2BafgydF4y2Ba．注意双阳性CCSPgydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ SftpCgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(*)在Badj，其中一些是脉冲标记(gydF4y2BajgydF4y2Ba)．192天追踪后，标记的双阳性细胞孤立(gydF4y2BakgydF4y2Ba)或连体(gydF4y2BalgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，在不同标记和谱系追踪条件下标记的肺细胞类型的量化。每种类型的标记细胞数和总细胞数进行评分(Badj分析CCSP)gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ SftpCgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞)显示为每个基因型和年龄分析。对于SftpC-Cre-ER系，还指出了他莫昔芬(他莫昔芬)的剂量和分析前的间隔时间。因为支气管维持只涉及增殖，而没有明显的细胞分散gydF4y2Ba50gydF4y2Ba(如我们发现的肺泡维护)，明显的CCSP的存在gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ SftpCgydF4y2Ba+gydF4y2Ba主要分离的老年细胞(>90%)表明它们对生理性细支气管更新没有显著贡献。d,天;PN,产后。比例尺，50 μm (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba)， 10 μm(插入gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
图5采用SftpC-Cre-ER追踪2型肺泡细胞谱系。gydF4y2Ba
在PN18给SftpC - cre - er > mTmG小鼠1 mg他莫昔芬(Tamox)，然后通过谱系标记(GFP，绿色)和AT2细胞(SftpC，红色)染色进行分析。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba， 13天后，只有AT2细胞被标记(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)，而在212天后，扁平的AT1细胞也表达AT2谱系标记(gydF4y2BabgydF4y2Ba)．示外周更新灶(虚线表示间皮)，包括多个肺泡(星号)，与LysM-Cre结果相似。定量显示，94%的AT2细胞在他莫西芬诱导后13天被标记，97%的AT2细胞在192天被标记gydF4y2Ba扩展数据图5mgydF4y2Ba)，表示SftpC . exegydF4y2Ba+gydF4y2Ba在生理老化过程中，新的AT2细胞并不来自于另一个细胞群。PN，产后日;Bar, 100 μm。gydF4y2Ba
图6肺泡2型(Alveolar type 2, AT2)创始人细胞功能标志物表达及自我复制gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba，并重新编程成AT1细胞gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba对16月龄LysM-Cre > Confetti小鼠肺进行mCFP谱系标记(绿色)、AT2细胞标记(Nkx2.1，红色)和DAPI(蓝色)染色，以确定克隆更新病灶。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba， AT2创始细胞(填充箭头)与子AT1细胞(开箭头)相关联，表达A2gydF4y2BalgydF4y2Ba标记物LAMP-1(白色)，一种与成熟分泌型AT2细胞中含有表面活性剂的溶酶体相关的蛋白质。gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BacgydF4y2Ba，克隆焦点(gydF4y2BabgydF4y2Ba(方框区域)，其中一个AT2细胞产生了两个额外的AT2细胞(填充箭头)，但没有AT1细胞(gydF4y2BacgydF4y2Ba(盒装区域特写)，显示孤立的自我复制，没有AT1细胞重编程gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba．比例尺，25 μm (gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba)．gydF4y2BadgydF4y2Ba、新鲜分离的AT2细胞(gydF4y2Ba图3 fgydF4y2Ba)在含10%血清的玻璃上培养4天，AT1形态平坦(E-cadherin，绿色)，启动AT1标记物表达(Aqp5，未显示)。比例尺，10 μm。gydF4y2Ba
扩展数据图7使用SftpC-Cre-ER和CCSP-Cre-ER对激活Kras的克隆反应。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba， SftpC-Cre-ER的肺(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)及CCSP-Cre-ER (gydF4y2BabgydF4y2Ba)携带致癌Kras的老鼠gydF4y2BaLSL-G12D / +gydF4y2Ba(Kras*)和Rainbow (Rbw)，注射3mg (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或1毫克(gydF4y2BabgydF4y2Ba)分别诱导StfpC-和ccsp阳性细胞的Kras*表达和克隆谱系标记。在PN43后17天对肺部进行分析(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或在PN81 (gydF4y2BabgydF4y2Ba)．注意，当SftpC-Cre-ER小鼠在25 (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)日龄，而在CCSP-Cre-ER小鼠中Kras*的诱导在42天(gydF4y2BabgydF4y2Ba)显示整个支气管(Br)有许多无反应细胞和双胞体，以及位于支气管肺泡管连接处(Badj)的小克隆肿瘤。gydF4y2BacgydF4y2Ba携带Kras*和mTmG等位基因的Sftpc-Cre-ER小鼠通过注射2 mg他莫司诱导PN116并在53天后分析也显示腺瘤。虚线为间皮;PN，产后日;比例尺，100 μm。gydF4y2Ba
图8肺泡2型(AT2)细胞源性腺瘤标志物表达分析gydF4y2Ba
mTmG, KrasgydF4y2BaLSL-G12D / +gydF4y2Ba(缩写Kras*)肺AT2谱系标记(绿色为GFP)，核染色DAPI(蓝色)，以及指示的AT2, AT1和Clara细胞标记(红色)。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba，注意肿瘤细胞(绿色)维持AT2标记物的表达(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba不要背叛克拉拉(gydF4y2BaegydF4y2Ba)或AT1标记(gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba)，除非可能是稀有的单元格(*)。gydF4y2Bac 'gydF4y2Ba而且gydF4y2Bad 'gydF4y2Ba显示AT1染色正常的对照(非肿瘤)区域(箭头)。比例尺，10 μm。gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
该文件包含补充表1-3。补充表1包含验证过的、健壮的肺泡上皮细胞标记物。表2显示了双潜能祖细胞和lysm谱系肺泡2型(AT2)细胞表达的受体基因百分比;EGF受体家族成员表达水平与探针特异性水平直方图。补充表3包含了双潜能祖细胞和lysm谱系肺泡2型(AT2)细胞在90%或更高百分位高度选择性表达的基因;并对这些基因谱进行注释富集分析。(PDF 475 kb)gydF4y2Ba
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德赛，T.，布朗菲尔德，D.和Krasnow, M.肺泡祖细胞和干细胞在肺发育，更新和癌症。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba507年,gydF4y2Ba190 - 194(2014)。https://doi.org/10.1038/nature12930gydF4y2Ba
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DOIgydF4y2Ba：gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1038/nature12930gydF4y2Ba
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