时间型I/III型干扰素模式和流感比较揭示了COVID-19中未调节的抗病毒免疫gydF4y2Ba

免疫的一个中心范式是干扰素(IFN)介导的抗病毒反应先于促炎反应，优化宿主保护并最大限度地减少附带损害gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba}．在这里，我们报告说，对于2019年冠状病毒疾病(COVID-19)，这一范式不适用。通过调查32例因肺炎住院的中重度COVID-19患者的暂时性IFN和炎症细胞因子模式，并对呼吸衰竭和死亡的发展进行纵向跟踪，我们发现IFN-λ和I型IFN的产生都减少和延迟，仅在一小部分患者中诱导，直到他们病情严重。相反，在所有患者中，促炎细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-6和IL-8先于干扰素产生，且持续时间较长。这种情况反映在血液转录组中，其中突出的IFN签名仅在同时表现出炎症加重的危重患者中可见。相比之下，在16例因肺炎住院且临床病理特征与COVID-19相似的流感(流感)患者和24例症状较轻的非住院流感患者中，IFN-λ和I型IFN在较早、较高水平且与疾病严重程度无关的情况下被强烈诱导，而促炎细胞因子仅急性产生。值得注意的是，COVID-19患者中较高的IFN-λ浓度与支气管吸出物中较低的病毒载量和更快的病毒清除有关，而较高的IFN-λ与I型IFN比值与危重患者预后的改善有关。此外，与流感相比，COVID-19患者细胞因子模式的改变与住院时间更长、危重症发病率和死亡率更高相关。这些数据表明，COVID-19的抗病毒反应未得到调节，导致病毒持续存在、过度炎症和呼吸衰竭。gydF4y2Ba

由乙型冠状病毒SARS-CoV-2引发的COVID-19已成为当今最严重的流行病之一，导致肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和死亡的高发病例gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．SARS-CoV-2感染最显著的特征之一是，它在很长一段时间内不被注意，持续数周的轻度或无并发症的疾病，直到在一组患者中出现突然和严重的症状，需要住院、氧气支持和/或进入重症监护病房(ICU)。gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba}．这种情况与病毒潜伏期异常长(2至14天)以及呼吸道中病毒存在时间异常长(通常在初次感染后一个多月仍可通过常规分子诊断检测检测到)相一致gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}．相比之下，流感病毒感染是迄今为止导致肺炎住院的主要呼吸道病毒，其潜伏期为1至4天，病毒呈阳性的窗口期很短，在1 - 3天内突然出现导致肺炎的症状gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}．其他常见呼吸道病毒，如呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒、间肺炎病毒和普通感冒冠状病毒的潜伏期也较短(1-5天)，症状表现更迅速和急性gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba这使得SARS-CoV-2在这方面非常独特。这种差异的基础尚不清楚，但很可能是COVID-19独特病程和临床表现背后的病理生理学的关键驱动因素。gydF4y2Ba

COVID-19的特征是出现高度炎症反应，也称为“细胞因子风暴”，损害气体交换功能，导致ARDS、多器官衰竭和死亡gydF4y2Ba^{10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}．我们和其他人先前已经证明，由IFN-λ (III型IFN)和I型IFN精心协调的抗病毒反应对于平衡免疫以获得最佳保护和最小损害至关重要gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}．偏离这种平衡会引发有害的“细胞因子风暴”，对人类健康造成毁灭性后果。最近的一项研究表明，在COVID-19患者中，不会产生I型IFN和IFN-λ，因为在一小部分临床特征不明的COVID-19队列的血清中无法检测到它们gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．相比之下，另一项研究报告称，I型IFN在COVID-19患者中被诱导，并表明其浓度在危重患者中可能降低gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．这种差异可能是由于这些研究都集中在一个明显不同的疾病过程的单一和可能不同的快照上。因此，追求动力学分析是有关描述免疫反应的过程，特别是考虑到细胞因子是短暂产生的。这一标准尤其适用于干扰素，它们在感染早期表达，并在感染后迅速下调。gydF4y2Ba

在这里，我们对32例COVID-19患者和16例因社区获得性肺炎住院的流感患者的I型和III型IFNs和主要炎症细胞因子模式进行了全面的时间分析，并根据当前的世界卫生组织指南进行了纵向随访gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．两组患者在入院时表现出相似的临床病理特征和相似的疾病严重程度(补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们还分析了24例较轻的流感病例，放射学上没有肺炎的发现，不需要住院治疗(称为轻度流感;补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，以及10个健康的人。使用高灵敏度Luminex和ELISA检测，我们定量了入院后在规定时间间隔内收集的患者血清中与抗病毒免疫和过度炎症相关的18种细胞因子和趋化因子(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．该分析根据相同的疾病症状和严重程度的临床标准(主要是是否存在肺炎和对氧气支持的需求)对患者进行排序。gydF4y2Ba

我们发现COVID-19患者的IFN-λ和I型IFN诱导均严重受损。在大多数COVID-19患者中未检测到IFN-λ和I型IFN(在检测定量限的中位数水平)，尽管一些患者产生了IFN-λ，少数患者也产生了IFN-α(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．这一观察结果与流感患者进行了对比，流感患者在入院的第一个(1-3天)时间间隔内几乎一致表达两种ifn类型，且浓度显著较高。在所有病例中，IFN表达均为短暂性，I型IFN水平在住院后3 d后迅速下降，而IFN-λ持续时间较长。值得注意的是，尽管COVID-19患者制造IFN的能力有限，但TNF、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IFN-γ和CCL3等促炎细胞因子在较长时间内保持高浓度表达(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．与健康个体相比，其他细胞因子如IL-1β、IL-12、IL-23和CCL4也在特定时间间隔内显著上调，反映了疾病病程的异质性(扩展数据图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

当根据疾病症状发作进行比较时，出现了类似的模式(扩展数据图)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．COVID-19患者IFN-λ和I型IFN水平明显延迟和降低，仅在部分患者中检测到，且从症状出现7-10天开始(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)．相比之下，所有流感患者在前6天表现出高水平的这些细胞因子(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)．尽管COVID-19患者在症状出现的前6天产生的干扰素很少，但他们强烈产生促炎细胞因子和趋化因子，如TNF、IL-6、IL-8、IL-10和CCL3，其浓度与流感相似(扩大数据图)。gydF4y2Ba3 b, cgydF4y2Ba)．此外，他们表现出促炎介质的延长表达，高浓度的TNF、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10和CCL4在发病后3周内仍可检测到，而在流感患者中，其中一些介质在发病后3周内下调。gydF4y2Ba

值得注意的是，COVID-19患者入院时的全身炎症标志物如c反应蛋白(CRP)浓度、白细胞(WBC)和中性粒细胞计数以及中性粒细胞/淋巴细胞(N/L)比与流感患者相似(补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．他们甚至有较低的发烧和较低的遏制-65评分，这是一种常用的衡量肺炎严重程度的指标gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba4 g hgydF4y2Ba)．然而，在随访期间，COVID-19患者的ARDS发病率要高得多，需要ICU支持。在我们的队列中，32例患者中有16例(50%)发展为危重疾病，其中3例死亡，而16例流感患者中只有3例(18.7%)，没有一例死亡(扩展数据图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．COVID-19患者在更宽的时间窗口内病情恶化(第一位患者在入院后第1天发病，最后一位患者在入院后第9天发病;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，而流感患者在入院后第一天内表现为病情危重。这一发现与COVID-19严重呼吸衰竭的高发病率和长时间病程相一致(参考文献)。gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba})．有趣的是，在COVID-19患者中，重症患者入院时CRP浓度、白细胞和中性粒细胞计数以及N/L比更高(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)，而不是CURB-65或发烧(扩展数据图。gydF4y2Ba4 g hgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．重症流感患者也有较高的WBC和中性粒细胞计数、N/L比和CURB-65的趋势，而非住院流感患者没有表现出任何这些增加(扩展数据图)。gydF4y2Ba4 a -gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

因此，我们检查了不同患者组之间的时间细胞因子模式是否不同。值得注意的是，我们观察到，尽管未发展为危重症的COVID-19患者很少产生I型或III型IFN，但与健康和非危重症患者相比，危重症患者的IFN-λ水平在第1-3天的时间间隔内显著升高(图1-3)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．一些危重患者也产生IFN-α(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，尽管与非住院的轻度流感患者相比，其数量显著降低(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)或流感住院患者总数(包括危重症和非危重症;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。相反，所有COVID-19患者均产生促炎细胞因子，如TNF、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-γ，危重患者在特定时间间隔内也表现出明显高于非危重患者的IL-6和IL-7浓度，且IFN-γ有升高的趋势，与他们所处的高度炎症状态增加一致(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．个别患者数据进一步证实了这些趋势(扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．非危重患者的CCL3明显高于健康对照组，但危重患者的CCL3明显高于健康对照组(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．相比之下，重症和非重症流感患者在制造I型和III型ifn的能力以及TNF、IL-6或IL-7等促炎细胞因子的能力上没有差异。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．同样，非住院的轻度流感患者表现出强烈的I型和III型ifn的产生，这表明在整个流感疾病严重程度的范围内，抗病毒反应仍然强劲。他们还表现出类似的促炎细胞因子的产生，如TNF, IL-6, IL-7, IL-8和IFN-γ，但与非危重或危重的住院流感患者相比，CCL3水平更高。在雷达图上可视化这些模式，揭示了COVID-19患者在诱导抗病毒反应和促炎反应方面的重大不平衡，而这在流感中没有发生(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，我们试图确定COVID-19患者中不平衡的细胞因子模式是否与全身免疫效应和与疾病严重程度相关的参数有关。为此，我们从5名健康个体和9名COVID-19患者(5名非危重症患者和4名危重症患者)中获得了暂时的WBC转录组，从进入病房或ICU的第一天开始，并在此后的不同时间点开始。总共分析了24个综合RNA-seq基因表达数据集。聚类分析显示，样本根据临床表型的严重程度分组，表明这是变异的主要来源，并提供了一种预测哪些患者将发展为危重或非危重疾病的方法(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．我们将第1天作为最相关的时间点，发现与健康个体相比，COVID-19患者中有4225个基因表达差异(补充表)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．当危重症和非危症患者与健康对照组分别比较时，分别观察到4214个和4902个差异表达基因(DEGs)，其中1979个是常见的，其余的是在一个或另一个患者组中唯一发现的(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba及补充表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在这些DEGs中，有2674个基因在危重症患者和非危重症患者之间也存在显著差异(补充表)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．火山图指出了组间高度调控基因的显著差异，危重患者表现出更强的免疫和抗病毒反应基因模式(图2)。gydF4y2Ba3汉英gydF4y2Ba)．对DEGs的通路分析确实显示，在危重患者中过度代表的最重要的通路与免疫系统的阳性调节、先天免疫反应的激活、对病毒的防御反应和对IFN的细胞反应有关(图。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．IL-1β产生途径的诱导和对IL-1的反应也很明显。相比之下，在非危重病患者中，除了IL-1β产生途径外，这些途径没有显著上调(图2)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．其他过度表达的途径包括调节细胞成分大小和自然杀伤细胞(NK)细胞毒性(图2)。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

因此，带有时间信息的热图揭示了在危重患者中大量抗病毒基因的强烈诱导，而在非危重患者组中只有一小部分基因上调(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba及补充表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．这组包括经典的抗病毒反应基因，可由I型和III型IFN诱导，如gydF4y2BaStat1gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba，gydF4y2BaIrf1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIrf2gydF4y2Ba，gydF4y2BaSocs3gydF4y2Ba，gydF4y2BaIsg20gydF4y2Ba，gydF4y2BaOaslgydF4y2Ba，gydF4y2BaIfi5gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfit1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaIfit5gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfitm10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba1英镑gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2英镑gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4英镑gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5英镑gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba6英镑gydF4y2Ba，在危重患者中均显著高于非危重患者或健康个体gydF4y2BaIrf3gydF4y2Ba，gydF4y2BaSocs3gydF4y2Ba，gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba，gydF4y2BaOas1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfi27gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfi44gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIfitm5gydF4y2Ba在非危重患者中也有上调，尽管上调幅度低于危重患者(补充表)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．第1天表达的抗病毒基因总集比较如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba证实危重症患者与非危重症患者差异有统计学意义(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.25 × 10gydF4y2Ba^{−20gydF4y2Ba})，这与这些患者中IFN-λ和I型IFN产生的不同模式一致。在危重患者中这种较强的I/III型IFN反应不太可能是由于IFN受体成分的较高表达，因为在两者之间没有观察到显著差异gydF4y2BaIfnlr1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl10rbgydF4y2Ba而且gydF4y2BaIfnar1gydF4y2Ba除危重患者Ifnar2水平增加两倍外，患者组和健康个体的mRNA水平(补充表)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

进一步的热图分析指出，重症患者的系统性先天免疫反应更强，其特征是关键促炎介质的表达增加，包括补体成分(gydF4y2BaC2gydF4y2Ba，gydF4y2BaC4bpagydF4y2Ba)，细胞因子(gydF4y2BaCsf1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCxcl10gydF4y2Ba)和基质金属蛋白酶(gydF4y2BaMmp8gydF4y2Ba，gydF4y2BaMmp9gydF4y2Ba)高于健康个体(图;gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．相反，非危重患者表达增强gydF4y2BaIl10gydF4y2Ba这是一种主要的抗炎蛋白抑制细胞因子风暴gydF4y2BaIl7gydF4y2Ba它参与维持T细胞外周的稳态。值得注意的是，炎症小体基因如gydF4y2BaNlrp6gydF4y2Ba，gydF4y2BaNrlc4gydF4y2Ba，gydF4y2BaNod2gydF4y2Ba，gydF4y2BaAim2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCasp9gydF4y2Ba，gydF4y2BaCasp10gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl1rngydF4y2Ba而且gydF4y2BaIl1r1gydF4y2Ba，这些都与IL-1β的产生或反应有关gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba，在COVID-19危重患者中也上调，而gydF4y2BaPycardgydF4y2Ba（gydF4y2BaAscgydF4y2Ba)，炎症小体组装的关键成分，在非重症患者中比健康个体中下调，表明IL-1β通路在更严重的疾病中起着突出的作用(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)．模式识别受体(PRRs)参与微生物识别，如gydF4y2BaDdx58gydF4y2Ba（gydF4y2Ba瑞吉gydF4y2Ba)，gydF4y2BaAim2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfih1gydF4y2Ba（gydF4y2BaMda5gydF4y2Ba)，gydF4y2BaIfi16gydF4y2Ba，gydF4y2BaTlr2和Tlr4gydF4y2Ba，也上调了。总体而言，当作为一组比较时，炎性小体和PRR基因如图2所示。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba两组间有显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 9.72 × 10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba})．在细胞类型水平上，基因表达分析显示显性激活的中性粒细胞/髓系细胞特征(gydF4y2BaMpogydF4y2Ba，gydF4y2BaElanegydF4y2Ba，gydF4y2BaCd177gydF4y2Ba，gydF4y2BaItgamgydF4y2Ba，gydF4y2Ba__arg1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCeacam8gydF4y2Ba而且gydF4y2BaFcgr1agydF4y2Ba)在危重症组中较轻，在非危重症患者中不显著(图。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．相反，T、B和NK淋巴细胞谱系及其相关基因(gydF4y2BaCd3dgydF4y2Ba，gydF4y2BaCd3egydF4y2Ba，gydF4y2BaCd4gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd8agydF4y2Ba，gydF4y2BaCd19gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd22gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNcam1gydF4y2Ba)在危重患者中明显下调。这些数据与淋巴细胞减少、高中性粒细胞计数和高N/L比在这些患者中也存在一致(扩展数据图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，之前报道过与COVID-19患者更严重的疾病和更糟糕的结果相关(参考文献。gydF4y2Ba^{3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba})．TNF、IL-6和IL-8等细胞因子可能直接导致这些影响，因为众所周知，它们会引发中性粒细胞的动员和激活、淋巴细胞减少的发展以及先天免疫反应和全身炎症的诱导gydF4y2Ba^{21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}．因此，COVID-19患者住院早期的WBC转录组可以提供有关疾病严重程度的重要信息，并指导治疗，如以更个性化的方式给药IL-1抑制剂。gydF4y2Ba

有趣的是，与流感相比，COVID-19肺炎患者中不平衡的细胞因子模式与更糟糕的疾病结局有关。首先，COVID-19组表现出更高的重症发病率和死亡率(扩展数据图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．其次，COVID-19患者，以及被分为重症和非重症的患者，比流感患者需要更长的住院时间(图2)。gydF4y2Ba5 a - cgydF4y2Ba)．对于COVID-19非危重症和危重症患者，中位时间分别为14和23 d，而流感患者为7和19 d(图2)。gydF4y2Ba5 b, cgydF4y2Ba)．延长住院时间可能归因于抗病毒反应的不协调，导致COVID-19的临床病程相对于流感更为漫长，即使是非危重症组也需要更长的恢复时间。gydF4y2Ba

确定能够预测住院时间的细胞因子和细胞因子组合，从而独立于已知的实验室和临床严重程度参数(如OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba饱和度，呼吸频率或N/L比)，我们生成了入院时(1-3天间隔)细胞因子水平与住院时间的相关矩阵(图1-3天间隔)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)．我们发现，较高的IL-6和IL-10浓度以及较低的CCL3浓度与住院时间成正比(图2)。gydF4y2Ba5 d-fgydF4y2Ba)．IL-6和IL-10作为监测COVID-19严重程度的生物标志物的价值已被报道gydF4y2Ba^{4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba}但对于CCL3来说，这是新的。值得注意的是，IFN-λ浓度还与较高的IL-6和IL-10以及较长的住院时间相关，这与危重症患者中几乎只有它们的诱导而非危重症患者一致(图2)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

出现的一个问题是，在危重患者中诱导的IFN水平是否有益，因为在动物模型中，I型或III型IFN的延迟产生已显示会引起免疫病理gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}或干扰上皮修复gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba},分别。我们发现，进入ICU期间较高的IFN-λ浓度与呼吸道中较低的SARS-CoV-2病毒载量和更快的病毒清除相关(图2)。gydF4y2Ba5克,gydF4y2Ba)．此外，当时较高的IFN-λ与I型IFN比值与较短的ICU住院时间有关(图2)。gydF4y2Ba5我gydF4y2Ba)，两名IFN-α水平最高的患者也表现出最长的住院时间(均为23 d，中位数为17 d)。这些数据表明，延迟IFN-λ诱导对COVID-19危重患者仍可能具有保护作用，而IFN-α可能弊大于利，至少在一部分患者中是这样。gydF4y2Ba

综上所述，我们的研究结果表明，SARS-CoV-2感染不遵循传统的抗病毒免疫范式。它不是首先激活抗病毒反应，然后是促炎过程作为第二道保护，而是相反;它会在干扰素介导的抗病毒防御被诱导之前很久就触发促炎反应。这种情况是一个主要的悖论，有助于解释COVID-19的许多独特或不寻常的特征。病毒在呼吸道中的长潜伏期和持续时间，使SARS-CoV-2检测呈阳性数周，可归因于I型和III型ifn的延迟和/或减少。患者在异常长时间内没有症状或症状非常轻微，可归因于I型ifn(流感样疾病的主要介质)的缺乏或受损和延迟表达，以及人类的流鼻涕、咳嗽、疲劳、呼吸困难和发烧等症状gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．最后，促炎细胞因子的早期和持续表达最终导致长时间的过度炎症，可促进呼吸衰竭的突然发展，需要住院治疗并经常进入ICU。值得注意的是，在流感中，I型和III型IFN反应的快速诱导，在疾病严重程度的范围内，与更快的恢复和显著降低危重疾病的发病率或死亡率相关gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}．最近一项对446名COVID-19患者的回顾性队列研究表明，早期给予IFN-α (IFN-a2b)与降低住院死亡率有关，而晚期IFN-α治疗会导致死亡率增加和延迟康复，毫无疑问，IFN产生的时间在COVID-19患者中也至关重要(参考文献)。gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba)．可以想象，I型或III型IFN的后期生产可能不会产生病毒抗性，而是促进免疫病理。gydF4y2Ba

COVID-19这种独特的临床病程是否与之前针对SARS-CoV提出的SARS-CoV-2衍生IFN抑制剂的存在有关gydF4y2Ba^{30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba}和MERS-CoVgydF4y2Ba^32gydF4y2Ba不知道，但有可能。与其他病毒一样，一旦达到较高的病毒载量，例如在病毒孵化并最终在易感人群中传播后，抑制作用可能会被克服。在我们的研究中，在测量干扰素时，我们没有发现非危和危重患者之间的病毒水平有显著差异(扩展数据图)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．然而，在一项研究中描述了严重疾病高于轻微疾病的病毒载量，但在另一项研究中尚未得到证实gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}．此外，较高的病毒载量可以克服SARS-CoV-2剂量依赖性抑制呼吸道上皮细胞IFN的产生gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们的研究并非没有需要注意的地方。首先，它表征了循环中的细胞因子模式，尽管这些通常用于分析感染反应中的“细胞因子风暴”，但它们与呼吸道免疫反应的相关性如何尚不清楚。其次，我们的研究规模相对较小，我们的发现有待其他队列的验证。尽管如此，我们的研究具有独特的信息性，因为它解决了从住院到ICU住院期间COVID-19中IFN的产生和“细胞因子风暴”的激活，因此对设计测试IFN疗法的临床试验特别有用。它还描述了IL-6和CCL3等生物标志物和基因表达特征，这些特征对于评估新入院的COVID-19患者的重症发展风险和住院时间特别有用。最后，它提供了COVID-19与流感的并排比较，研究了具有相似遗传、人口学和临床病理特征的患者群体，因此揭示了这两种疾病之间抗病毒免疫反应的重要差异，这是以前没有怀疑过的。gydF4y2Ba

研究参与者gydF4y2Ba

在这项非介入性研究中，纳入了32例根据世界卫生组织指南诊断为COVID-19肺炎并对呼吸道样本(鼻咽拭子或支气管吸痰)进行SARS-CoV-2 PCR - RT-PCR检测阳性的患者gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．患者于2020年3月至4月期间从1gydF4y2Ba^圣gydF4y2Ba希腊雅典“索蒂里亚”胸科综合医院呼吸和重症监护诊所病房和重症监护室。纳入时SARS-CoV-2 RT-PCR阴性的健康无症状个体作为对照组。gydF4y2Ba

根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗指南第七次修订试行》进行病例严重程度分类gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba．所有患者均为中重度疾病，并表现为呼吸道症状和肺炎影像学表现。他们符合以下任何一个标准:gydF4y2Ba

1. 1.gydF4y2Ba

   呼吸窘迫(≥30次/分钟)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}）;gydF4y2Ba

2. 2.gydF4y2Ba

   静息时氧饱和度≤93%;gydF4y2Ba

3. 3.gydF4y2Ba

   动脉血氧分压(PaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)/吸入氧分数(FiO .gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)≤300mmhg，无其他器官衰竭。gydF4y2Ba

16例患者出现急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸衰竭(PaO)引起的危重症gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/ FiOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba≤200mm Hg)需要机械通气，伴有休克和/或其他器官衰竭，需要ICU监护。在住院期间和出院时，在不同的时间间隔抽血;收集白细胞和血清保存，待进一步使用。gydF4y2Ba

为了更好地了解COVID-19感染的免疫反应，还研究了一组确诊患有H1N1/H3N2甲型流感病毒感染的患者。2018年12月至2019年5月期间，共招募了40名患者gydF4y2Ba^ndgydF4y2Ba希腊雅典“Sotiria”胸科综合医院呼吸科门诊和希腊雅典雅典大学医学院“Attikon”大学医院。使用BioFire FilmArray呼吸面板测试(bioMerieux)从鼻咽拭子获得确认。与COVID-19患者类似，流感患者根据疾病的严重程度分为轻度病例(放射学上无肺炎，不需要吸氧支持和住院)和中度至重度病例(放射学上有肺炎(x线或计算机断层扫描)，需要吸氧和需要住院的症状)gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba．住院流感患者被细分为未发生流感的患者(PaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/ FiOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba> 200毫米汞柱)或发展为危重疾病(PaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/ FiOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba≤200mm Hg)。流感患者入院时与COVID-19患者具有相似的临床病理特征(补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．所有纳入研究的患者在整个住院期间(从入院到出院)进行了临床评估和纵向随访。所有血液标本立即处理用于血清收集，并在−80°C保存。此外，还收集了10名中位年龄为54.5岁(41-70岁)的健康个体(3名男性，7名女性)的血清作为对照组。gydF4y2Ba

该研究符合《赫尔辛基宣言》中概述的原则，并获得了希腊雅典“Sotiria”胸科综合医院伦理委员会(批准号16707/10-7-18和8385/31-3-20)和希腊雅典雅典大学医学院“Attikon”大学医院伦理委员会的批准(批准号1821A/22-9-16)。所有参与者提供书面知情同意书。gydF4y2Ba

SARS-CoV-2检测gydF4y2Ba

根据制造商说明书，使用Nuclisens easyMAG仪(bioMerieux)从鼻咽拭子和支气管吸出物中提取RNA。鼻咽拭子用于初步诊断，而支气管吸痰用于评估ICU的病毒载量。对提取的SARS-CoV-2病毒E基因核酸进行实时RT-PCR检测gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

细胞因子分析gydF4y2Ba

使用MILLIPLEX MAP人类高灵敏度T细胞仪(默克Millipore)分析在−20℃下冷冻和储存的血清样本中IFN-γ、TNF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12 (p70)、IL-13、IL-17A、IL-23、CCL3、CCL4和CX3CL1的存在。解冻的血清等分在13000转/分离心。测试前，在4°C下放置10分钟。每项检测都根据制造商的血清样品方案进行，使用推荐的样品稀释和标准曲线浓度(Merck Millipore)。样品在Luminex 200系统上使用Luminex xPonent v.3.1软件，按照制造商说明书(Merck Millipore)进行分析。每种试验中每种细胞因子的最低检出限均为pg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}IFN-γ 0.50, TNF 0.42, IL-1β 0.2, IL-2 0.24, IL-4 0.60, IL-6 0.16, IL-7 0.33, IL-8 0.30, IL-10 0.50, IL-12 0.24 (p70)， IL-13 0.20, IL-17A 0.50, IL-23 8.00, CCL3 2.00, CCL4 0.80, CX3CL1 10.00。采用高灵敏度夹心ELISA试剂盒检测人IFN-α (Abcam)和IFN-λ1 (bilegend)。敏感性以pg ml为单位gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}IFN-α为1.00,IFN-λ1为2.00。采用Biotek Gen5 v.1.05软件进行数据采集和分析。gydF4y2Ba

RNA-seq分析gydF4y2Ba

RNA-seq分析使用RNeasy Micro kit (QIAGEN)从全血白细胞中纯化总RNA。RNA样本用DNase I (QIAGEN)处理，并在NanoDrop(赛默飞世尔科学公司)上定量。使用TruSeq RNA文库准备试剂盒v.2制备下一代测序文库(Illumina)根据制造商的说明。使用安捷伦2100生物分析仪上运行的安捷伦DNA 1000试剂盒验证文库的质量。此分析返回日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在每个时间点，与健康人相比，治疗组的变化是两倍。所有COVID-19重症和非重症患者的DEG转录本均根据调整后的数据选择gydF4y2BaPgydF4y2Ba值截断为0.05(错误发现率(FDR)为5%)。对重症和非重症COVID-19 deg进行了额外的统计比较。使用Cytoscape的ClueGO和CluePedia插件对健康个体的DEGs进行通路富集分析。使用TM4 MeV v.4.8进行热图，并使用欧氏距离进行分层聚类。在R中分别使用hclust函数和ggdendro包进行聚类和树状图。gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

在NextSeq 500 (Illumina)上测序的样品使用标准协议进行分析。简单地说，使用FastQC v.0.11.2和cutadapt v.1.6对原始reads进行预处理，然后使用TopHat版本2.0.13、Bowtie v.1.1.1和Samtools版本v.1.1将原始reads映射到人类基因组(GRCh38)。读取计数表是使用HTSeq v.0.6生成的。在至少一个数据集中过滤原始读取计数，阈值为10，总共得到21880个基因。DESeq2分析gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba在危重患者和非危重患者、健康个体、危重患者和非危重患者中进行。此分析返回日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在每个时间点，与健康人相比，治疗组的变化是两倍。DEG转录本的选择基于调整后的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值截断0.05 (FDR 5%)。通路富集分析使用Cytoscape的ClueGO和CluePedia插件进行。使用TM4 MeV v.4.8进行热图，并使用欧氏距离进行分层聚类。在R中分别使用hclust函数和ggdendro包进行聚类和树状图。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据采用GraphPad Prism软件进行分析。采用Mann-Whitney法评估细胞因子水平差异的统计学意义gydF4y2BaUgydF4y2Ba-test非参数数据。细胞因子水平与住院时间(以天为单位)之间的相关性采用Spearman秩序相关系数进行检验，并使用corrplot R包进行可视化。基因组间差异的统计学意义用双尾学生评估gydF4y2BatgydF4y2Ba-test参数数据。使用来自ggplot2 R包的极坐标图来可视化细胞因子反应模式的差异。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然研究报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba

支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。原始RNA-seq数据已存入Gene Expression Omnibus (gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)gydF4y2BaPRJNA638753gydF4y2Ba并且是公开的。gydF4y2Ba

作者感谢A. Gavriil和G. Vatsellas的技术援助，感谢P. Katsikis (Erasmus医学中心，荷兰)和V. Soumelis (Institut de Recherche Saint-Louis, Université de Paris，法国)对手稿的批判性阅读。E.A.由欧盟委员会(European Commission)的研究拨款支持(IMMUNAID, no。779295和CURE，不是。希腊研究与创新基金会(INTERFLU, no. 767015)。1574)和詹森制药公司。ieg是由希腊研究与创新基金会(relief, no。506)。这项工作得到了希腊胸科学会的资助和乔治·安德烈斯·桑切斯·帕帕斯皮里欧家人和朋友的捐赠。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 这些作者对这项工作做出了同样的贡献:Ioanna-Evdokia Galani, Nikoletta Rovina。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 雅典学院生物医学研究基金会，临床、实验外科和转化研究中心，免疫生物学实验室，希腊雅典gydF4y2Ba

   Ioanna-Evdokia Galani, Vicky Lampropoulou, Vasiliki Triantafyllia, Maria Manioudaki, Eleftherios Pavlos和Evangelos AndreakosgydF4y2Ba

2. 希腊雅典国立和卡波distrian大学医学院呼吸内科第一重症监护室，索蒂里亚胸科总医院，雅典gydF4y2Ba

   Nikoletta Rovina & Antonia KoutsoukougydF4y2Ba

3. 希腊雅典国立和卡波distrian大学医学院呼吸内科第一科，索蒂里亚胸科总医院，雅典gydF4y2Ba

   Evangelia Koukaki, Vasiliki Panou & Nikolaos KoulourisgydF4y2Ba

4. 希腊雅典，雅典大学医学院，Attikon大学医院内科四科gydF4y2Ba

   Paraskevi C. Fragkou, Vasiliki Rapti & Sotirios TsiodrasgydF4y2Ba

5. 希腊雅典“索蒂里亚”胸科总医院第二呼吸科门诊gydF4y2Ba

   Ourania KoltsidagydF4y2Ba

6. 希腊巴斯德研究所微生物学系，希腊雅典gydF4y2Ba

   Andreas健全的gydF4y2Ba

7. 英国伦敦帝国理工学院国家心肺研究所气道疾病感染科gydF4y2Ba

   Evangelos AndreakosgydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

N.R、S.T、A.K.和E.A.设计了这项研究;i.e.g.、N.R、V.L、V.T、E.K、P.C.F、V.P、V.R、O.K.、e.a进行患者资料和样本采集;V.L.和E.A.为下游分析处理和制备样品;e.k.、p.c.f.、v.p.、v.r.、O.K.和N.K.进行了医学评估;i.e.g.、N.R、V.L、v.t、e.a进行细胞因子测定;i.e.g.、M.M.和E.A.进行RNA-seq分析;A.M.测量病毒载量;i.e.g.， N.R, v.l.， V.T, M.M, E.P, E.K, A.K.和E.A.对数据进行了分析和解释;E.A.起草了手稿并监督了这项研究。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaEvangelos AndreakosgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba

同行评审信息gydF4y2Ba同行评审报告是可用的。gydF4y2Ba自然免疫学gydF4y2Ba感谢匿名审稿人对本工作的同行评议所作的贡献。L. A. Dempsey是本文的主要编辑，并与编辑团队的其他成员合作管理其编辑过程和同行评审。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba