肝细胞生长因子与前列环素合成酶在重度肺动脉高压大鼠中的基因转移

摘要

客观的肝细胞生长因子(HGF)是一种多能生长因子，对肺损伤有抗纤维化作用。在本研究中，我们研究了人HGF基因转移是否可以减弱肺动脉内侧肥大，并增强前列环素对monocrotaline (MCT)诱导的大鼠肺动脉高压的改善作用。方法与结果: MCT注射前一天，将含有HGF基因(H组)、PGIS基因(P组)cDNA的hvj -脂质体复合物转染大鼠肝脏，作为肺给药系统。转染对照载体的大鼠为对照组(C组)。MCT注射后28天，组织学检查显示肺动脉内侧壁明显增厚，右心室肥厚。对照组外周肺动脉内侧壁厚度百分比(%WT)、右心室(RV)与左心室(LV)的压力比、右心室(RV)与左室(LV)加室间隔的重量比均显著升高。与C组比较，H组和HP组内壁厚度百分数明显改善。P组和HP组左室压重比均较C组明显改善，HP组较P组明显改善。结论:体内转染HGF基因可减轻MCT大鼠肺动脉内侧肥大，增强前列环素对肺动脉高压的改善作用。因此，HGF和PGIS的基因治疗可能是治疗重度肺动脉高压的一种有前途的策略。

1介绍

肺动脉高压(PH)是一种由多种疾病引起的进行性致命疾病，其特征是肺血管阻力增加，导致右心室衰竭。组织学上，内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖、细胞外基质异常堆积导致肺动脉内侧壁增厚是多种PH的关键特征，既见于特发性家族性，也见于与之相关的危险因素，如先天性心脏病的高血流动力学，或二尖瓣不全的左心室功能障碍，或肝功能障碍(1 - 3)．

越来越多的证据表明基因转染有改善进行性ph的潜力。[4]经气管转染prostacyclin synthase (PGIS)基因减弱了monocrotaline (MCT)诱导的PH，并证明PGIS基因转染到肝脏作为给药系统可以减弱MCT诱导的PH［5］．尽管有报道支持前列环素对肺血管平滑肌细胞有抗增殖作用(6、7)在我们之前的研究中，PGIS基因转移对减弱内侧增生的影响是最小的。

肝细胞生长因子(HGF)，最初被纯化和克隆为一种有效的肝细胞有丝分裂原[8]在多种细胞类型中具有有丝分裂、促运动、形态发生和抗凋亡活性[9]．HGF的多能活性是由一个膜跨酪氨酸激酶受体介导的c-met原癌基因[10]．在生理上，HGF作为一种器官营养因子，用于包括肝脏在内的器官的再生和保护[11]、肾[12]，和心[13]．关于HGF在肺中的生物学和嗜肺作用，它对肺实质细胞具有有丝分裂、形态发生(诱导分支小管形成)和抗细胞死亡作用，并在肺再生和保护肺损伤中发挥作用(14 - 18)．此外，HGF在慢性肺损伤后的抗纤维化作用导致了治疗肺部疾病的治疗方法[19]．因此，HGF基因转移联合PGIS似乎是治疗严重PH患者的一种有前景的策略。

在本研究中，我们确定了体内HGF基因转染是否可以减弱肺血管疾病的进展，并增强PGIS改善PH的效果。

2材料与方法

2.1动物护理

本研究在动物研究委员会的监督下，根据大阪大学医学院动物实验指南和日本政府动物保护管理法进行。

2.2质粒DNA构建

为了获得HGF表达载体，将人HGF cDNA插入pucc - sr α表达载体质粒的Not I位点[20]．在该质粒中，HGF cDNA的转染受SRα启动子的控制。人类PGIS的表达载体由Tanabe博士(国家心血管中心药理学部)提供。该质粒是通过插入钝化质粒构建的欣d III /Bam将人PGIS全长cDNA的HI片段导入pUC/CAGGS表达质粒的钝化Xho I位点。我们还构建了不含HGF基因和PGIS基因的对照表达载体。

2.3 hvj脂质体的制备

日本血球凝集病毒(HVJ)脂质体复合物的制备在其他地方有描述[21]．简单地说，通过旋转蒸发器去除四氢呋喃，将10mg脂质混合物(磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇)沉积在烧瓶的一侧。用137.0mM NaCl, 5.4mM KCl, 10.0mM Tris-HCl;pH 7.6)，含有DNA (200μg)-HMG1(高迁移率1族核蛋白，64μg)复合物。通过涡流、超声和振荡制备脂质体- dna - hmg1复合悬浮液。脂质体悬浮液与30,000个HVJ颗粒一起孵育，这些颗粒之前通过紫外线照射灭活，首先在4°C，然后在37°C。通过蔗糖梯度离心后，收集含有hvj脂质体的层4ml供使用。

2.4手术入路与肺动脉高压模型

重量为100-110g的Wistar大鼠腹腔注射50mg/kg氯胺酮(Sankyo Co.)联合5mg/kg xylazine (Bayer Co.)麻醉。

40只大鼠按上述方法行小中线剖腹手术，肝左叶注射脂质体［5］．简单地说，用剪刀进行中线剖腹手术。反射肝左叶，用30号针和1ml注射器注射0.5ml hvj脂质体-质粒复合物(0.4ml，含20μg cDNA)。在这个过程中，注入的体积使肝脏表面膨胀，使其呈现半透明的外观。然后用3-0丝线逐层闭合腹膜肌、软组织和皮肤。动物们被允许在温暖的环境中休养。将表达载体HGF cDNA或PGIS cDNA转染到每10只大鼠(H组或P组)。将同时携带HGF和PGIS cDNA的表达载体转染另外10只大鼠(HP组)，将不携带HGF和PGIS的表达载体转染另外10只大鼠作为对照组(M组)。基因转染后第1天给大鼠注射60mg/kg的野百合碱(西格玛)。另10只大鼠注射等量生理盐水作为对照组(C组)。 Rats in each group were sacrificed 28 days after MCT injection (图1）.

2.5人HGF表达

为评价转染人HGF基因后的表达情况，再转染15只大鼠，分别于第4、7、14、21和28天处死3只大鼠。然后取出肝、肺、肾、心脏左叶，用乙醇固定染色。转染对照载体的大鼠的这些器官也准备作对照(图1）.

2.6左右心室压力和重量测量

麻醉大鼠，插管，通气。用电灼小心地进行正中开胸术以防止出血。然后，用24号针测量左右心室压力，该针与传感器(TERUMO)和测谎系统(Nihon Kohden Co.)连接。该测量进行了三次，并计算平均值。然后，心脏和肺被全部切除。心脏被隔离，测量右心室和左心室加室间隔的重量，如其他地方所述。通过位于肺动脉主干的导管注入冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)，清除肺部的血液。所有染色组织用乙醇固定。

2.7组织学分析

组织标本取自肝左叶、肺、肾和心脏的横切面。组织标本用乙醇阻塞，石蜡包埋，切片。石蜡切片采用标准的直接过氧化物酶-抗过氧化物酶方法，用兔抗人HGF多克隆抗体免疫染色。简单地说，将4μm厚的石蜡包埋材料切片，安装在涂有3-氨基丙基三乙氧基硅烷的载玻片上，在室温下风干一夜。切片在二甲苯中脱蜡，在乙醇中再水化，用含0.3%过氧化氢酶的甲醇阻断内源性过氧化物酶30分钟。切片与兔抗人HGF多克隆抗体在4°C下孵育过夜。以1:300稀释的生物素化山羊抗兔IgG (DAKO)为二抗，室温孵育30min。用亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物孵育后(Vector Labs)，用DAB观察过氧化物酶，然后用DAB增强溶液孵育(Vector Labs)。切片用苏木精反染色，并裱片。切片也用苏木精和伊红染色。 Medial wall thickening was assessed as the percent medial wall thickness as described elsewhere.

2.8统计分析

所有数值均以均数±标准差表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后进行Bonferroni/Dunn事后检验(post-hoc test)。一个P< 0.05为差异有统计学意义。

3的结果

3.1基因转染引入人HGF的表达

转染后第4天和第7天用抗人HGF多克隆抗体进行免疫组化检查，H组肝细胞细胞质中人HGF明显广泛表达(图2B)，而不是在C组(图2A).然而，转染后第14、21和28天均未检测到人HGF。在肾脏、心脏和肺中，在转染后的任何一天都未检测到人HGF。

3.2基因转染后肺小肺动脉及其他器官的组织学改变

为了确定组织学改变，我们检查了肺标本的小肺动脉，并以内侧壁增厚百分比来评估内侧壁增厚。各组均有典型的肺动脉小动脉图3A. H组和HP组小肺动脉内侧壁增厚百分比明显低于对照组，P组无明显差异。HP组与P组比较有显著性差异(表1，图3B).我们的研究结果表明，HGF基因转染后对肺动脉高压的内侧肥大有显著的改善作用。

另一方面，肾脏和心脏标本没有组织学改变。

3.3左右心室压力和重量比的变化

为了评估MCT注射后肺动脉高压的进展，以及HGF和/或PGIS基因转染的影响，我们测量了左右心室压力，并测量了右心室和左心室加间隔的重量。然后，我们计算了右心室与左心室的压力和重量比。P组和HP组这两项指标均较C组有明显下降，H组无明显下降。HP组左室与左室的压力和重量比显著低于P组(表1，图4A和B)。

4讨论

在本研究中，我们通过hvj脂质体将HGF基因转染到肝脏，在体内诱导人HGF蛋白在肝脏过表达，减弱肺动脉内壁增厚，增强PGIS基因转染对mct诱导的大鼠PH的改善作用。

在之前的报告中，我们证明了PGIS基因转染到肝脏可以改善mct诱导的PH值［5］内侧壁厚度组织学改善最小。因此，我们引入了HGF和PGIS共转染的新策略。我们选择HGF的原因是考虑到它对各种疾病的抗纤维化功能(11、12、19)．前列环素致血管扩张与HGF抑制肺动脉内侧肥大联合应用可增强血流量，降低肺血管阻力。正如预期的那样，本文的数据首次表明HGF对肺动脉内侧肥大有改善作用，并增强了PGIS对PH的治疗效果。

此前，小池等人。(22、23)在缺血后肢模型中，HGF和PGIS共转染，血流和毛细血管密度增加更多。他们描述了共转染的协同效应是通过PGIS的血管扩张效应和HGF的血管生成效应来实现的。据我们所知，在这个模型中，HGF的抗纤维化作用似乎有助于与PGIS共转染的协同效应。考虑到HGF的多能作用，HGF与PGIS共转染改善PH的机制有待进一步研究。

我们在肝脏中检测到人HGF，但在心脏、肺或肾脏中未检测到，这表明特异性转染到肝脏。ELISA无法检测到循环人HGF，可能是循环HGF水平低于试剂盒的检出限(0.3ng/ml)。针对这一点，我们进行了初步研究，发现在该模型中腹腔注射抗人HGF抗体对肺血管疾病没有预防作用，并且我们在之前的研究中通过该方法成功检测了循环中的前列环素代谢物［5］，因此我们认为人HGF在肝脏中表达，到达肺并影响肺血管。

第4、7天检测到HGF基因表达，第14、21、28天未检测到HGF基因表达。这种相对较短的基因表达时间可能是单纯转染HGF基因没有明显改善肺动脉高压的原因。最近，我们也在该模型中对肺进行了经动脉HGF基因转染，显示了组织学和血流动力学的影响。肺动脉的组织学分析显示，肺动脉平滑肌细胞的增殖和胶原沉积明显受到抑制(数据未显示)。这些数据表明，与直接基因转染肺相比，通过给药系统基因转染肝脏需要足够大的剂量才能影响肺动脉，具有血流动力学作用。考虑到该方法在治疗PH的临床应用，需要一种新的、复杂的基因转染方法，使基因表达时间长，保持药物的有效血药浓度而无任何副作用。

本研究的主要局限性是该模型是通过基因转染来预防肺动脉高压的，我们没有进行模拟临床治疗晚期肺动脉高压的治疗研究。

综上所述，我们证明了HGF的基因转移增强了PGIS改善大鼠PH的作用。虽然在不同的PH模型中还需要进一步的研究，但这些数据表明HGF在减弱肺血管疾病中的作用，提示与PGIS共转染可能成为治疗严重PH的一种新的基因疗法。

作者要感谢Akiko Nishimura在制备hvj -脂质体方面的出色技术支持。这项工作得到了日本科学研究补助金的支持。

参考文献