红细胞吸附活性的流感病毒神经氨酸酶的功能意义及其蚀变大流行性病毒的疫苗

人类流感病毒基因来自禽流感病毒。禽流感病毒的神经氨酸酶(NA),除了催化部位,一个单独的唾液酸结合位点(红细胞吸附网站),不存在在人类病毒。的生物学意义NA红细胞吸附在禽流感病毒的活动仍然难以捉摸。数据库序列分析显示,多数人的NAs的人类对于H2N2病毒隔离在1957年的流感大流行不同于他们的假定的禽流感前体红细胞吸附氨基酸替换的站点。我们发现代表大流行性病毒的NA /新加坡/ 1/57 (H2N2)缺乏红细胞吸附活动这一回归avian-virus-like序列(N367S)恢复红细胞吸附。使用这个hemadsorption-positive NA,我们生成的三个与替换S370L NA变异,n400和W403R红细胞吸附中发现人类对于H2N2病毒的网站。每个替换废除红细胞吸附活性。虽然没有NA变异的红细胞吸附活动之间的相关性及其对单价基质酶活性,所有四个hemadsorption-negative NAs desialylated大分子基质显著低于hemadsorption-positive同行。1918年大流感病毒的NA /胡尔汀/ 1/18 (H1N1)也不同于禽流感N1 NAs降低红细胞吸附活动和大分子底物的水解效率更低。我们的数据表明,红细胞吸附网站服务增强钠的催化效率,他们建议,除了血凝素的受体结合特异性的改变,需要改变的NA大流行性流感病毒的出现。

A型流感病毒携带两个表面糖蛋白,血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)承认同一宿主细胞分子,唾液酸。HA介导病毒结合唾液acid-containing细胞表面受体启动感染(综述文献[28,42])。钠是一种从glycoconjugates劈开唾液酸酶在细胞外抑制剂、细胞和子代病毒,从而促进病毒进入细胞膜上的受体结合,促进释放子代病毒,防止其受体介导self-aggregation [2,10,30.,35]。x射线分析几个甲型和乙型流感病毒的NAs透露,催化部位是深口袋NA表面形成的氨基酸残基在NA守恒的类型和子类型(4,11,41,49]。

携带的病毒HA (H3N2, 1968)或血凝素和神经氨酸酶(H1N1, 1918;H2N2, 1957)来自禽流感病毒导致上个世纪发生过三次流感大流行(引用文献综述。54])。1918年的病毒被认为是一种avian-like病毒全部来自一个不知名的动物宿主(45]。1957年大流感是由包含基因的重组病毒HA、NA和PB1 H2N2禽流感病毒和其余目前人类H1N1病毒传播。1968年大流感病毒获得H3从禽流感病毒HA和PB1和其余的基因包括NA的当代人类H2N2病毒。因此,NAs H2N2和H3N2人类病毒代表的后裔鸟类NA,人类在1957年被引入。转变的受体结合特异性的禽流感病毒HA Neu5Acα2-3Gal识别Neu5Acα2-6Gal识别被认为是先决条件的生成大流行性病毒(25,26,47),但是,没有功能变化在1918年和1957年的禽流感NAs病毒已确定到目前为止。

已经知道了一段时间的NA禽流感病毒除了催化网站一个单独的唾液酸结合位点和显示红细胞吸附活性抑制剂,不可阻挡的催化部位(16,20.,23]。负责红细胞吸附的氨基酸残基被测序鉴定单克隆逃避突变体的N9 NA,失去了这个活动53)和N2的定点诱变和N1 NAs (16,20.,34]。N9 NA的复杂的晶体结构有两个唾液酸残基会催化部位和红细胞吸附网站解决(48]。红细胞吸附站点是一个浅口袋位于附近的三肽表面形成的深度催化部位和循环。六残留这些循环直接与红细胞吸附的唾液酸残基网站(见图。1a、b)。除了少数例外,五个氨基酸(367年代,370年代,372年代,400 n和403 w)是守恒的九种抗原亚型禽流感病毒NAs的(20.,48]。Kobasa et al。20.)检查代表大多数抗原亚型禽流感的NAs,人类和猪病毒。他们发现,所有禽流感病毒NAs拥有高水平的红细胞吸附活动而N1和N2 NAs的人类病毒呈现出弱得多的活动。这一发现与保护的氨基酸形成红细胞吸附的NA在禽流感病毒和缺乏这样的保护人类和猪病毒(20.,48]。综上所述,这些概念表明,红细胞吸附的NA有一些鸟类在病毒复制的作用,但不是必要的或不利的病毒复制人类。然而,废除红细胞吸附活动的禽流感病毒NA的定点诱变并没有显着影响的鸭肠病毒复制的实验条件下(20.]。与大多数禽流感病毒H9N2病毒从亚洲家禽被发现拥有显示human-virus-like受体特异性和NAs红细胞吸附包庇氨基酸替换的站点(1,24,29日]。序列分析表明,突变的NA红细胞吸附的H9N2病毒导致积极的选择性压力变化表明网站的损失增加病毒在家禽陆基健身(29日]。

无论是NA红细胞吸附的功能在禽流感病毒,也没有确切的时间和机制的跨物种传播后消失。它注意到替换S370L降低红细胞吸附活动伴随减少50%的鸟类N2 NA NA酶活性(20.]。然而,其他几个单个或多个氨基酸替换在N1和N2 NAs废除红细胞吸附活动对酶活性没有明显的影响(16,53]。这些结果反对一个一致的红细胞吸附站点在钠的催化活性。可能这个网站在病毒附件的作用受体在鸟类提出38,48]。没有证据支持这一假说的可用;此外,抗体NA未能抑制病毒的附件(23不同意它。

在这项研究中,我们希望指定NA红细胞吸附的功能作用。为了解决这个问题,我们生成的几个变种NA的大流行性流感病毒株/新加坡/ 1/57 (H2N2)不同于彼此的氨基酸替换关键职位的红细胞吸附网站和红细胞吸附活性。我们分析了NAs Cos-7表达细胞的酶活性和相应的重组病毒和得出结论,红细胞吸附网站有助于提高钠的催化活性。

病毒、细胞和试剂

流感病毒/新加坡/ 1/57 (H2N2)存储库的病毒学研究所的马尔堡。Madin-Darby犬肾(MDCK)和非洲绿猴肾成纤维细胞(Cos-7)在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞补充谷氨酰胺FCS的10%和1%。2′- (4-methylumbelliferyl)N-acetylneuraminic酸(MU-NANA)、3′-sialyl -N-acetyllactosamine (3 sln), 6′-sialyl -N-acetyllactosamine (6 sln)和牛胎球蛋白从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。Peroxidase-conjugated anti-rabbit抗体来自DAKO(德国汉堡)。人工气道粘蛋白类收集来自人类tracheo-bronchial上皮分化的顶端表面文化准备如前所述[14,30.]。合成sialylglycopolymers 3 sl-paa和6 sln-paa,包含20 mol % 3′-sialyllactose sl(3)和6 sln,分别连接到溶性聚丙烯酰胺载体(9尼古拉)请提供的博文和亚历山大Tuzikov,生物有机化学研究所,莫斯科,俄罗斯。pHW2000质粒(17)请提供的埃里克·霍夫曼和罗伯特·韦伯斯特,圣裘德儿童研究医院,孟菲斯,TN,美国。Anti-H9N2抗体是由沃尔夫冈•加滕请提供病毒学研究所马尔堡。

克隆和基因定点诱变

全长基因的NA /新加坡/ 1/57 (H2N2病毒(SG / 57)放大了rt - pcr从孤立的RNA和结扎pHW2000质粒Bsm如前所述(BI限制网站17,18]。氨基酸替换的红细胞吸附网站NA-pHW2000介绍了质粒使用工具包Quikchange定点突变技术[Stratagene, (La Jolla、钙、美国)]。编码序列的原始和突变NAs subcloned进pCAGGS / MCS质粒(20.,33)使用Xho我/Sma我限制的网站。胡尔汀的全长NA基因/ / 1/18 (H1N1)病毒(基因库AF250356)合成了商业(美国新泽西州皮斯卡塔韦Genscript公司)。质粒pHH21-FPV-NA和波尔我Sap投入/ Italy-NA编码的NA基因/鸡/废票罗斯托克/ 34 (H7N1) [50)和鸵鸟/意大利/ 984/00 (H7N1)是由拉尔夫·瓦格纳和Bjoern没人,病毒学研究所马尔堡。N1 NA基因扩增和菌进行基因克隆到pCAGGS / MCS向量使用生态RI /不我限制的网站。M基因的编码序列/香港/ 1/68 (H3N2)从pHW2000-M subcloned质粒(25到Xho我/Sma我网站pCAGGS / MCS的质粒。质粒的身份被测序证实。

化验的表达水平和红细胞吸附NAs的活动

在96 -孔板层的Cos-7细胞生长与pCAGGS-NA转染质粒使用Lipofectamine 2000(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国)。空pCAGGS质粒用于mock-transfected控制。单层细胞转染48小时后,与4%多聚甲醛固定在4°C和孵化20分钟连续两个稀释的兔子anti-H9N2病毒抗体,随后peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白抗体。结合抗体水平与过氧化物酶底物测定o苯二胺和量化通过测量吸光度在490海里。计算的相对表达水平对NA的NAs /新加坡/ 1/57(如表所示1相应的吸墨性的),我们使用比率anti-H9N2抗体稀释1/1,600纠正mock-transfected细胞的吸光度。

NAs测定的红细胞吸附活动与NA表达水平的测定使用复制Cos-7细胞转染培养48 h后转染。单层细胞孵化与1%的鸡或人类红细胞悬浮液在4°C 30分钟。Non-bound红细胞被清洗,绑定红细胞染色使用diaminobenzidine过氧化物酶底物的解决方案。的文化与甲醇,固定和核Cos-7阿尔新蓝细胞被沾1% 3%醋酸。量化红细胞吸附活性,我们确定的平均数量每十Cos-7红细胞吸附细胞的分析至少250 Cos-7 /复制文化在奥林巴斯IMT-2显微镜下观察20×目标。

酶活性的表达了NA

在96孔板的层的NA-expressing Cos7-cells与唾液acid-containing孵化基质CaCl Ca-TBS缓冲区(4毫米₂0.02米,三,0.85%氯化钠;pH值7)在37°C。水解的MU-NANA量化通过测量荧光的发布4-methylumbelliferone如前所述[27]。唾液酸解放从荧光底物测定在不同时间点(从5分钟到6 h)硫代巴比土酸测定(43,52]。特定的NA活动(每分钟pmole唾液酸释放/文化)计算的线性范围发布唾液acid-versus-time情节。

代的重组病毒

重组病毒rgHAD−和rgHAD +控制,分别的基因hemadsorption-negative(−)野生型SG / 57 NA及其hemadsorption-positive (+) N367S变异生成使用八个质粒反向遗传系统(如前所述17]。七其他基因的病毒来自1968年大流感病毒/香港/ 1/68 (H3N2),因为相应的质粒已经可以从我们的先前的研究25]。病毒空斑纯化,生长在MDCK细胞并存储在整除−80°C。所有病毒基因的身份被测序证实。

酶活性的重组病毒

重组病毒的股票rgHAD +和rgHAD−分析其内容的非还条件下的NA和M1蛋白sds - page和immuno-blotting使用anti-H9N2流感病毒抗体,peroxidase-labelled二级抗体和ECL衬底(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。研究NA酶活动,股市调整等于NA内容并与唾液acid-containing孵化基质。唾液酸的解放是量化在不同时间点对cell-expressed NAs如上所述。确定病毒的能力NA摧毁唾液酸受体细胞,我们使用一个hemagglutination-elution化验。连续两个稀释的病毒在50μl PBS U-bottomed微量滴定板被孵化1 h在4°C 50μl 0.5%的人类红细胞悬浮液。解集virus-agglutinated细胞监测在37°C。

吸附desialylated / resialylated红细胞

人类红细胞携带Neu5Acα2-3Gal或Neu5Acα2-6Gal准备如前所述[半个13,36]。总之,100μl 10%人类红细胞desialylated使用100亩霍乱弧菌唾液酸酶(贝林AG)、马尔堡、德国)和resialylated 60分钟37°C使用0.5μ鼠α2-3 - (N)-sialyltransferase或2.5μ鼠α2-6 - (N)-sialyltransferase (Calbiochem坏Soden,德国)的1.5毫米CMP-sialic酸(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。Resialylated红细胞被用来执行红细胞吸附试验如上所述。

从1957年流感大流行的NAs H2N2病毒株携带红细胞吸附氨基酸替换的站点

H2N2/1957 NA基因的流行病毒起源于鸟类前体;这个基因后来继承了H3N2/1968流行病毒(40,54]。先前的研究表明,H2N2 NAs和H3N2人类分离的病毒在1966多个氨基酸的变化红细胞吸附网站和缺乏红细胞吸附活动(20.,29日,34,48]。然而,它仍然是模糊的结构和活动的变化是否红细胞吸附网站已经发生在H2N2流行病的爆发。

为了解决这个问题,我们分析了当前可用的N2 NA序列的国家生物技术信息中心流感病毒资源(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)。两个病毒株的排斥,所有测序人类大流行性病毒隔离在1957年和1958年怀有替换的保守立场红细胞吸附网站,S367N或S370L(无花果。1c)。在N9 NA复杂的结构模型与两个唾液酸分子(48),侧链上羟基的367年代和370年代的蛋白质形成氢键的羧基氧和8-OH组唾液酸,分别(无花果。1b)。替换S367N和S370L影响这些氢键,此外,可以创建sterical障碍住宿的唾液酸的红细胞吸附网站。三种病毒从1957年包含除了367/370 (D369E或P431Q)替换第二个变化。既不是369也不是431年的N9 NA接触唾液酸残基。然而,D369朝溶剂的侧链49),可能与唾液酸或倒数第二个糖残基的红细胞吸附N2 NA。替换P431Q可以改变430年循环的方向,影响残留432和403的位置,与唾液酸进行交互。

列宁格勒/ 57和足立/ 2/57没有替换的六个位置接触唾液酸的红细胞吸附网站。前病毒的HA avian-virus-like受体特异性,因此被认为是一个突变体派生在实验室通过使在受孕的鸡蛋(26]。序列的第二个病毒的HA和一段历史都不知道。

两个病毒分离株从1958年开始,马来亚/ 16/58和奥尔巴尼/ 24/58,分别替换n400 N400K,。氨基酸在这个位置并不保存在不同亚型的NAs (20.,48),然而,主链和侧链原子400 n与唾液酸残基的N9 NA(无花果。1b),这表明替换在这个位置可能影响稳定的复杂。所有测序分离的病毒在1958年之后怀有S370L替换和红细胞吸附累积额外替换网站。特别是,替换W403R发生1965年之后可能会影响蛋白质的相互作用与5N乙酰基的唾液酸(无花果。1b)。因此,五替换红细胞吸附网站(S370L, n400、N401D W403R, P431K)是独立的末的NA H2N2病毒隔离/东京/ 3/67和H3N2流感病毒的NA /香港/ 1/68从一个假定的禽流感的前兆。

的影响在第二唾液酸结合位点氨基酸替换N2 NA的红细胞吸附和酶的活动

评估表型的影响红细胞吸附的替换人类H2N2病毒网站,我们关注的NA H2N2大流行性病毒/新加坡/ 1/57。NA的红细胞吸附网站不同于假定的鸟类祖先的一个氨基酸替换S367N(无花果。1c)。此前报道19,21)、SG的NA / 57酶活性高,显示优先裂解α2-3-linked唾液酸和支持复制禽重组病毒的鸭肠。因此,除了替换在367位置,SG的NA / 57是禽流感病毒NA的典型代表。我们放大SG的长篇NA基因/ 57从孤立的RNA, rt - pcr cDNA克隆到哺乳动物表达质粒pCAGGS / MCS和引入了单点替换,N367S,恢复序列的鸟类红细胞吸附网站。使用这个avian-virus-like NA,我们准备三个NA与氨基酸替换S370L变种,分别n400和W403R(表1)。这组5个NAs模仿NA红细胞吸附的假定的禽流感前体(变体N367S)和1957年大流行的病毒传播的不同对于H2N2病毒大流行的最初几年,然后(无花果。1c)。

研究NA的属性变量,我们用pCAGGS-NA质粒转染Cos-7文化细胞。48小时后,我们分析了NA表达水平的细胞,红细胞吸附和酶的活动。NAs都表达在细胞表面(表1)。人类和鸡红细胞有效绑定到细胞表达avian-virus-like NA (N367S)。相比之下,NA SG / 57和其他三个NAs与红细胞吸附human-virus-like氨基酸替换网站显示显著的红细胞吸附(无花果。2;表1)。这些数据表明,大多数的最早可用从1957年大流感病毒分离株,以及随后的隔离,缺乏高红细胞吸附活性的禽流感NAs由于突变红细胞吸附网站。

相比我们的下一个酶活动的NAs Cos-7细胞使用几种基质(表中表示1)。低分子质量底物2′- (4-methylumbelliferyl)N-acetylneuraminic酸(MU-NANA)、3′-sialyl -N-acetyllactosamine (3 sln)和6′-sialyl -N-acetyllactosamine (6 sln)每分子包含一个唾液酸残基。高分子基质胎球蛋白、人工气道粘蛋白合成sialylglycopolymers 3 sl-paa和6 sln-paa [9包庇sialyloligosaccharide根的多个副本。胎球蛋白和粘蛋白包含3-linked和6-linked唾液酸残基,而sialylglycopolymers是单一的,包含3-linked (3 sl-paa)或6-linked (6 sln-paa)残留。所有五个NAs裂解3 sln速度远远超过6 sln符合已知的禽流感病毒链接特异性NAs (5,16,19]。四个NAs (SG / 57、N367S N367S-N400S和N367S-W403R) desialylated每个的单价sialosides相同的效率,表明氨基酸替换的红细胞吸附网站没有影响相邻的催化基团的酶活性。变体N367S-S370L水解3 sln约有30%的低效率比其他NAs。类似的效应被Kobasa和他的同事报道(20.)发现,替换S370L禽流感对MU-NANA N2 NA的酶活性下降。尽管缺乏相关性NA红细胞吸附单价sialosides活动和水解,所有四个hemadsorption-negative NAs desialylated大分子底物高效少2 - 5倍比hemadsorption-positive avian-virus-like N367S NA变体。这些发现表明,氨基酸替换1957年红细胞吸附网站大流行性病毒导致酶活性降低而假定的禽流感的前兆。有趣的是,在大多数情况下,减少并非由于直接影响的突变在功能上相邻的催化部位。

酶活性的重组病毒包含hemadsorption-positive和hemadsorption-negative NAs

以证实NAs表达的实验结果,我们测试了NA红细胞吸附的影响活动的背景下,完整的病毒粒子的催化活性。使用8-plasmid反向遗传学系统[17),我们生成的两种重组病毒,rgHAD−rgHAD +,包含hemadsorption-negative NA的SG / 57及其hemadsorption-positive突变N367S,分别。每个病毒的其他七个基因片段来自1968年大流感病毒/香港/ 1/68 (H3N2) [25]。我们确定NA比基质蛋白在病毒免疫印迹。没有发现差异之间rgHAD−rgHAD +(无花果。3),表明氨基酸367 NA并入病毒粒子没有影响。基于免疫印迹分析,我们调整病毒股票悬浮液浓度相同的NA(图。3酶活性(图)和比较。3b)。病毒酶活动的模式同意观察NAs Cos-7细胞中表达。因此,病毒没有水解能力单价不同基质MU-NANA, 3 sln和6 sln,然而,该病毒与hemadsorption-negative NA desialylated大分子基质明显更慢比rgHAD +。

比较NAs的分裂能力从受体表达在细胞表面的唾液酸,我们研究了病毒从人类红细胞洗脱。我们孵化与红细胞病毒1 h在4°C和监控解集virus-agglutinated细胞在37°C。病毒标准化对NA和M蛋白(图的内容。3显示相同的红细胞凝集的活动在4°C(无花果。3c,前面板)。完整的崩溃通常发生在6和8 h(孵化的rgHAD +(无花果。3c,下半部分)和24至48 h的rgHAD−(数据没有显示)。这些实验表明,该病毒与hemadsorption-negative NA破坏红细胞受体更慢比hemadsorption-positive同行。

根据这些数据,我们得出这样的结论:网站功能血细胞吸附的存在增强了病毒相关的容量NA移除唾液酸可溶性高分子基质和细胞。

红细胞吸附网站结合α2-3-linked和α2-6-linked唾液酸

网站描述绑定红细胞吸附的特异性自然唾液酸对两个主要决定因素(Neu5Acα2-3Gal和Neu5Acα2-6Gal),我们使用人类红细胞desialylated使用霍乱弧菌唾液酸酶,然后使用α2-3——或者α2-6-sialyltransferases resialylated。正如所料,desialylated红细胞失去能力结合Cos-7细胞表达hemadsorption-positive NA变体N367S(无花果。4)。Resialylation红细胞部分恢复了绑定虽然修改红细胞绑定效率低于本地红细胞。似乎,减少红细胞吸附活性resialylated细胞至少部分由减少的唾液酸水平相比,本机红细胞(36]。然而,随着α2-3和α2-6-resialylated红细胞显示大量的红细胞吸附活动,我们得出这样的结论:红细胞吸附的NA可以结合唾液酸附加到倒数第二糖链通过链接类型。

理解能力的分子基础的红细胞吸附网站绑定到3-linked和6-linked唾液酸,我们可用的晶体结构相比红细胞吸附的N9 NA (48)与受体结合部位的H3公顷(15(图。5)。的哈,氨基酸226 220 -循环和氨基酸190 190 -螺旋已知与asialic 3-linked和6-linked受体,主要负责识别的联系(见评论(28,42])。没有结构相当于190 -螺旋红细胞吸附的NA。此外,370 - NA循环坐落在一个相对较低的位置220 -循环血细胞吸附网站比相应的受体结合部位的哈。例如,绑定唾液的糖苷氧之间的距离和最近的氨基酸受体结合部位的3.8公顷(谷氨酰胺在226位置);相应的距离最近的氨基酸在第二唾液酸结合位点的NA(位置369)大约是更长时间。因此,红细胞吸附站点的能力适应α2-3和α2-6-linked唾液酸可以解释缺乏密切的氨基酸同行的交互与倒数第二唾液酸糖残基(年代)。

红细胞吸附和酶的活动NA的1918年大流行的病毒

人类流感病毒来源于的N1 NA NA的病毒引起的流感大流行在1918年(39]。最早的人类H1N1病毒隔离测试,/ PR8/34和/罗马/ 49,显示弱,如果任何,红细胞吸附活动(20.]。1918 NA的特征属性,我们合成的NA基因/胡尔汀/ 1/18 (H1N1)使用序列由瑞德和他的同事们决定[39](基因库AF250356)。我们比较红细胞吸附和催化活动的NA与两个N1禽流感病毒的NAs /鸡/废票/罗斯托克/ 34 (H7N1)(废票)和鸵鸟/意大利/ 984/00 (H7N1) (Os /意大利)使用与转染Cos-7细胞化验。废票NA被选中,因为它是接近1918 NA系统(39)和循环的时间;意大利Os / NA NA代表更遥远。三个N1 NAs的表达水平在细胞表面都是相同的在这些实验的结果根据细胞和抗体ELISA废票(数据没有显示)。1918 NA病毒与人类红细胞显示大量的红细胞吸附,尽管红细胞吸附活性人工繁殖的水平低于禽流感N1 NAs(无花果。6)。1918 NA显示弱得多和鸡红细胞吸附红细胞(低于禽流感NAs五到十倍)。因此,类似于1957年大流感病毒的NAs, 1918 NA病毒减少红细胞吸附活性。然而,对于1918 NA减少明显低于在1957 NA。

1918 NA的酶活性,与3 sln化验时作为基质,是相同的废票NA NA的约30%低于Os /意大利(表2)。有趣的是,1918 NA desialylated sln比禽流感N1 NAs快两倍。所有三个NAs裂解6 sln-paa相同的效率;然而,1918 NA呈现出减少的活动对其他三个多价基板测试。比较N1 NAs的能力区分单价和多价基质,我们计算特定酶活动的比率3 sl-paa / 3 sln和6 sln-paa / 6 sln(表2)。比率都是至少两个较小的1918 NA比禽流感NAs,表明衬底的polyvalency低1918 NA对催化效率的影响。这些结果同意数据N2 NA NA的突变体,表明红细胞吸附活动提高其催化活性对多价大分子基质不改变单价底物的水解率。

在这项研究中,我们解决了一个长期问题的功能意义红细胞吸附网站出现在NA禽流感病毒(20.,23,48]。为此,我们克隆人类大流行性病毒的hemadsorption-negative NA /新加坡/ 1/57 (H2N2)和生成hemadsorption-positive avian-virus-like变体以及其他三个hemadsorption-negative human-virus-like变异与单一氨基酸替换红细胞吸附在不同位置的网站。我们下一个使用这个面板五NA变异来确定替换废除红细胞吸附NA的活动会影响酶活性。所有hemadsorption-negative变异了的酶活性显著低于hemadsorption-positive总统对所有高分子基板测试。重要的是,四分之三的hemadsorption-negative变体(S367N, n400和W403R)没有不同于hemadsorption-positive NA的水解能力低分子量单价sialosides。这一发现表明,这些变异的催化活性下降主要是由于红细胞吸附的损失导致的直接影响的活动,而不是替换在血细胞吸附站点的结构邻催化部位。

类似于流感病毒NA,一些细菌NAs, NAs等霍乱弧菌,perfringens梭状芽胞杆菌和小单孢菌属viridifaciens除了催化领域有凝集素域。例如,N-lectin-like领域霍乱弧菌NA结合唾液酸(31日]。这些植物血凝素域功能还不理解,但相信他们增加酶的催化效率(见文献[31日,32)和引用)。这里我们提供直接的实验支持这个假说被证明具有功能性的流感病毒NA红细胞吸附网站酶活性高于hemadsorption-negative单点突变体。Thobhani et al。46)报道,细菌NAs,额外的凝集素域,水解多价基质比相应的单价sialosides显著提高催化效率。作者解释这种效应增强亲和力的NAs多价基质。我们的研究结果是一致的这一机制。因此我们假定的红细胞吸附流感病毒NA NA的用于提高催化效率绑定自然多价的基质,从而招募和保留他们附近的酶。

豪斯曼et al。16使用3′)化验酶活性的N1 NA -sialyllactose和6′-sialyllactose,发现基因定点突变的红细胞吸附网站没有影响。我们的数据解释的失败和其他先前的研究[20.,53)发现的功能角色NA红细胞吸附网站既不研究多价底物使用。Bousse Takimoto et al。7,8,56)近日发现,地利亚鸡新城疫病毒(NDV)和仙台病毒在hemagglutinin-neuraminidase第二个唾液酸结合位点(HN)的蛋白质。他们证明了氨基酸替换这些网站的病毒对NA活动没有影响化验使用3′-sialyllactose。将有趣的测试,地利亚的第二个结合位点HN是否可以促进多价的desialylation基质。

两个先前的报告表明,红细胞会hemadsorption-positive N9和N1 NAs无法释放的病毒NA活动,但被广泛公布活跃的细菌的唾液酸酶(3,16]。这些数据表明,红细胞吸附站点可以绑定到一个身份不明的物种或链接的唾液酸不敏感的乳沟NA的催化部位。N1 NA以前发现绑定到3-linked和6-linked受体(16]。我们这里显示N2 NA亚型也结合链接类型。分析NA红细胞吸附站点(图的结构特征。5)解释了红细胞吸附站点无法区分6 - 3-linked唾液酸和预测,这个网站可以有一个相对广泛的结合特异性。这些发现的生物学意义还有待确定。在任何情况下,绑定non-cleavable衬底半个似乎并不是一个先决条件的hemadsorption-mediated增强催化效率、增强效应的观察单特异性sialylglycopolymers 3 sl-paa和6 sln-paa(无花果。3b)不携带non-cleavable唾液酸残基。

在我们的实验与重组病毒,该病毒与hemadsorption-positive NA没有显示更高的红血球凝聚活动和红细胞比hemadsorption-negative洗脱放缓。这些结果表明,红细胞吸附的NA不明显导致HA-mediated绑定细胞受体或受体的hemadsorption-dependent增强乳沟优于hemadsorption-mediated增强的附件。因此,我们的数据不支持假设的红细胞吸附流感病毒NA发挥了重要作用,病毒对靶细胞(38,48]。

两个上世纪流感大流行是由病毒引起,派生从禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶(H1N1, 1918;H2N2, 1957)(引用文献综述。40,54])。转变的HA的受体结合特异性Neu5Acα2-3Gal识别Neu5Acα2-6Gal识别被认为是必不可少的这些大流行性病毒的出现25,26,47),而功能变化在其NAs尚未确定。例如,知道1967年以后人类分离的病毒的N2 NA怀有替换的红细胞吸附网站和缺乏红细胞吸附活动(20.,34),然而,由于缺乏测序和表型数据尚不清楚发生了什么事的红细胞吸附活性N2 NAs第一年1957年的大流行。此外,分析H2N2和H3N2病毒与人类之间的1957年和1987年显示逐渐变化的相对活动N2 NA 3 -和6-linked唾液酸和绝对酶活性(5,19,21]。然而,第一个表型变化观察到病毒从1960年代早期,而一些测试NAs H2N2病毒隔离从1957年似乎完全保留酶禽流感的前兆特征。在这项研究中,我们首次展示,NA导致1957年流感大流行的病毒不同于他们的假定的鸟类祖先红细胞吸附氨基酸替换的站点,缺乏红细胞吸附活性和催化活性降低。替换不同位置的红细胞吸附站点(367、370和400年)出现在独立N2血统(见图。1),这表明红细胞吸附网站受到正选择压力变化和它在某个时间点被摧毁后初始avian-to-human传输时,在人类大流行性病毒开始传播。两个替换,S367N W400N,只有红细胞吸附行为的影响,而替换S370L也边际直接影响催化部位的活动根据一些单价底物的水解率的变化(表1和裁判。20.])。有趣的是,只有天堂与S370L变化,显示最低的酶活性对所有测试基板继续循环后1957 - 1958年的大流行,这可能是由于更好的健身NA的人类。病毒与S370L替换孤立1958年后累积额外突变红细胞吸附站点(图。1c)。鉴于S370L变化足以废除红细胞吸附活动,这些突变的功能意义尚不清楚。因为NA抗原的红细胞吸附网站与一个网站(53),我们推测,这些额外的突变有网站hemadsorption-negative人类NAs代表NA的抗原漂移。

与1957年大流感病毒的NA,唯一可用的N1 NA序列的1918年大流感病毒39]没有替换的六个关键氨基酸红细胞吸附网站,接触唾液酸。然而,这NA显示显著降低红细胞吸附活性和降低酶活性比两个鸟类N1 NAs测试。虽然还需要进一步的研究来证实这些发现,并指定他们的分子机制,我们的数据表明,NA /胡尔汀/ 1/18可能已经从其假定的不同鸟类的祖先在鸟类。

病毒NA的角色在病毒生命周期是缓解不利的HA与受体的相互作用通过消除粘液毯的唾液酸,细胞表面和子代病毒(2,10,30.,35]。因为他们的反对活动,需要血凝素和神经氨酸酶功能平衡,确保NA破坏诱饵受体抑制剂,可以绑定到HA但不过分妥协病毒进入易感细胞功能受体的过早破坏。这种平衡取决于主机-和组织模式的唾液acid-containing受体和病毒复制抑制剂出席现场。血凝素和神经氨酸酶之间的平衡可以被各种事件,如病毒传播到新的主机物种或基因重组与收购一个新的HA / NA组合;结果减少病毒健身可以克服补偿性突变的哈,NA或蛋白质(审查,看看裁判。51])。因此可以推测,酶活性的改变1957年大流感病毒的NA(和可能的1918年大流感病毒)服务来弥补病毒HA的受体结合活性的变化和转换病毒最初适应鸟类的肠上皮细胞(21,54)人类呼吸道的新环境。20世纪第三大流行的NA (H3N2, 1968)源于当代人类H2N2病毒,因此缺乏红细胞吸附活性,显著降低酶活性(5,20.,21]。因此,在这种情况下,平衡似乎已经恢复通过收购NA基因直接从人类的病毒,而不是逐渐适应禽流感病毒NA的点突变。

最近的人类感染H5N1, H7N7 H9N2禽流感病毒提高新流行的担忧和突出适应性变化的缺乏充分理解所需的禽流感病毒基因的出现大流行病毒(12,37]。HA适应高效结合的重要性Neu5Ac2-6Gal-terminated受体在人类呼吸道上皮是公认的提供一个评估禽流感病毒的大流行潜力的标志(6,22,29日,55]。我们的研究结果表明,遗传和功能NA代表另一个指标的变化对人类不断适应的禽流感病毒。

这项研究得到了德意志Forschungsgemeinschaft (SFB 593)和由欧盟FP6项目维吉尔,FLUPATH FLUINNATE。我们感谢e·霍夫曼和r·韦伯斯特pHW2000向量用于反向遗传学,n .博文和A . Tuzikov sialylglycopolymers,即加普亚和g . Cattoli /鸵鸟/意大利/ 984/00 (H7N1)病毒,r·瓦格纳和b为N1 NA-expressing质粒,没人答:Maisa和w·加滕anti-H9N2抗体和德拉诺科学PyMOL的免费版本。

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