文摘
间充质基质细胞(MSC)已报告改善细菌间隙在临床前模型的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和败血症。这种效应的机制还没有完全阐明。本研究的主要目的是探讨假设MSC体内的抗菌效果取决于他们调制通过线粒体转移发生的巨噬细胞吞噬功能。我们建立了选择性耗尽鼻内的肺泡巨噬细胞(AM)(在)脂质体clodronate管理导致完全废除MSC在体内模型的抗菌效果大肠杆菌肺炎。此外,我们表明,MSC管理与增强吞噬体内。我们表明,直接coculture MSC monocyte-derived增强巨噬细胞吞噬能力。通过荧光成像和流式细胞术我们展示了丰富的线粒体转移从MSC巨噬细胞发生至少部分通过隧道纳米管(TNT)式结构。我们还发现,肺巨噬细胞容易获得MSC体内线粒体,线粒体和巨噬细胞阳性MSC吞噬活动显示更明显。最后,部分抑制线粒体转移通过MSC的TNT形成堵塞导致未能提高巨噬细胞生物能疗法和完全废除MSC在体外对巨噬细胞吞噬作用的影响和MSC体内的抗菌效果。集体,这项研究首次表明,线粒体转移MSC导致增强先天免疫细胞的吞噬活性和揭示了一个重要的小说MSC在ARDS的抗菌效果的机制。
在手稿中,我们表明,肺泡巨噬细胞对细菌的清除效果与MSC治疗至关重要的老鼠大肠杆菌肺炎。此外,我们第一次报告,人类骨髓间充质干细胞(MSC)中提取线粒体转移他们的巨噬细胞在体内和体外通过隧道纳米管(TNT)和微泡的分泌。这导致增强巨噬细胞吞噬作用和改进的生物能学。线粒体捐赠细胞通过直接接触提供了一个新颖的抗菌作用的重要机制MSC条件复杂的细菌感染。鉴于这些发现,我们相信这个手稿代表显著进步的理解功能性质的MSC和为他们提供了额外的证据治疗潜在的急性炎症性肺部疾病。
我ntroduction
急性呼吸窘迫综合征是残疾和死亡的主要原因在危重患者的死亡率取决于疾病的严重程度(25 - 40%1]。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)有许多临床表型与最常见的原因是细菌和病毒性肺炎和败血症。ARDS病理生理学的主要特征是肺过度炎症(2]。常驻巨噬细胞是免疫反应的关键协调器。肺泡巨噬细胞(AM)的第一行是先天免疫细胞远端呼吸道负责检测和消除入侵的病原体,以及启动初期的宿主免疫反应。
间充质干细胞(基质)细胞自我更新的多能成体干细胞可从骨髓中分离和许多其他组织和器官(3,4]。在体外条件下,它们可以分化成多种细胞类型(5]。这些细胞具有再生、免疫调节、抗菌作用。近年来,MSC被证明在几个ARDS的临床前模型包括保护作用体外人工肺灌注模型(6- - - - - -14]。这些结果已经通知MSC在ARDS的临床试验的设计。在两个小随机第一阶段的研究中,塑料附着MSC被证明是安全的和中度到重度的ARDS患者的耐受性良好,和二期临床试验的疗效目前正在进行的(15,16]。成功复苏的两个严重耐火ARDS患者被报道在同情的基础上经过政府的MSC治疗(17]。
尽管临床前模型的快速翻译显示MSC的有利影响肺部受伤进入临床试验,这些细胞的机制发挥其抗炎和恢复功能仍不清楚。基于MSC治疗原理发展的,我们需要更好的理解他们的行动的机制在肺部受伤。
机制MSC增强微生物间隙是特别重要的,急性炎症条件如ARDS往往复杂或者由细菌感染引起的。因此,潜在的治疗药物,同时减少炎症不应妨碍主人的对抗感染的能力。值得注意的是,在体内活细菌引起的ARDS模型,MSC持续展示能力不仅减少炎症,而且提高细菌清除率。我们组已经证明了MSC在ARDS的抗菌效果部分由他们的抗菌肽和蛋白质的分泌10)和主机单核细胞的吞噬能力的调制9],[11]。这种能力的MSC或MSC-derived微泡增强宿主先天免疫细胞的吞噬能力已经被其他研究者报道,但这种影响的机制尚未完全阐明,18- - - - - -20.]。
尽管许多研究已经证明,msc的有利影响是依赖于旁分泌机制包括微泡或外来体释放(10,12,20.- - - - - -23),有越来越多的证据表明细胞直接接触MSC和肺上皮或内皮细胞,使线粒体转移,也很重要。伊斯兰教等人报道,从MSC线粒体转移到肺泡II型上皮细胞(ATII)改善生存在脂多糖(LPS)全身肺炎小鼠模型通过ATII生物能学概要文件的恢复。直接接触细胞通过之间的联接蛋白43缝隙连接形成所需MSC和ATII线粒体捐赠(24]。从MSC线粒体转移到支气管上皮细胞通过隧道纳米管(TNT)保护在哮喘和慢性阻塞性肺病的体内模型(25,26]。同时,线粒体捐赠MSC通过TNT报道是保护内皮细胞的体外模型,再灌注损伤(27]。然而,这仍然是未知的细胞contact-dependent机制是否参与MSC线粒体转移到先天免疫细胞和线粒体转移将如何影响他们的能力清除细菌。
在这项研究中,我们测试了MSC的假设可以通过TNT和巨噬细胞的线粒体转移,这将增强巨噬细胞吞噬活性。之前的这些研究的结果被发表在一个抽象的形式(28]。
米aterials和米治疗
详细描述见支持信息。
人类骨骨髓来源间充质干细胞(MSC)
人类骨骨髓来源获得msc德州农工大学健康科学中心大学的医学、再生医学研究所(寺庙,德克萨斯州,美国),NIH存储库。细胞符合所有的标准定义的分类一样msc国际社会的细胞治疗(29日]。抑制剂实验用细胞松弛素B (Sigma-Aldrich,多塞特郡,英国,www.sigmaaldrich.com),在完整细胞孵化α-MEM补充1%胎牛血清(FCS)和500 nM抑制剂1.5 - 2小时5%的股份有限公司2和37°C。细胞被洗了三次与杜尔贝科的磷酸缓冲盐(DPBS)在体外和体内研究。
人类直接Coculture Monocyte-Derived巨噬细胞(MDM)和MSC
在每个实验之前,MSC使胰蛋白酶化,计算,用无菌1 x DPBS resuspended rpmi - 1640中1% FCS和添加到文化的主要人类巨噬细胞在1:20 MSC / MDM比率。细胞与LPS刺激(大肠杆菌O111: B4,生物实验室列表(加州坎贝尔www.listlabs.com)10 ng / ml)或生活大肠杆菌的年代火车K1的莫伊10 4或24小时。每个实验进行了一式三份,使用细胞至少三种不同捐赠者的MDM从北爱尔兰输血服务(NIBTS)。淡黄色的外套NIBTS捐赠的使用伦理批准学校贝尔法斯特女王大学的研究伦理委员会。
线粒体隔离和人工转移
线粒体与MSC进行隔离使用培养细胞的线粒体隔离设备(热费希尔科学(英国佩斯利www.thermofisher.com根据制造商的指示)。孤立的线粒体在RPMI resuspended 1% FCS的最后细胞计数MSC,维护在冰和立即使用人工转移。孤立的线粒体转移到MDM体外进行根据Caicedo et al。30.]。
在活的有机体内大肠杆菌肺炎模型
小鼠麻醉和灌输为3.5×106CFU的大肠杆菌K1的体积35µl鼻内(在)。4小时后老鼠接受了MSC治疗(1×106细胞/鼠标)静脉注射(IV)在100年通过尾静脉µl PBS,或鼻内35µl PBS(在鼻内管理的情况下,老鼠收到气体(异氟烷)麻醉短暂固定)。控制老鼠对待同一卷PBS的车辆控制。老鼠被过量的全身麻醉监测和安乐死24或48小时后感染和broncho-alveolar灌洗液(BALF)或者肺采集样本进行分析。给药途径并不影响MSC能力减少肺损伤的严重程度,减少炎症和提高细菌清除率。类似比例的人类MSC在第四管理局从BALF中恢复过来后,表明MSC回家时空域静脉注射(支持信息图S1A,就是S1C)。
流式细胞术
MSC沾200 nM MitoTracker深红色(热费希尔科学(英国佩斯利www.thermofisher.com为45分钟)5%的股份有限公司2实验前和37°C。鼠标BALF细胞或肺匀浆与抗体染色CD11c (PE或APC), CD11b (APC-e-Fluor780) F4/80 (PE-Cy7) Gr-1 (e-Fluor450或PerCP-Cy5,www.ebioscience.com)或适当的免疫球蛋白(所有从eBiosciences,哈特菲尔德,英国)和人类巨噬细胞是沾anti-CD45 (PE或APC)或适当的免疫球蛋白g控制(eBiosciences)。细胞进行了分析使用FACSCanto二流式细胞分析仪和FlowJo软件(树明星)。
我被封闭的Gr-1吗−F4/80+CD11c嗨CD11b低,总Gr-1肺巨噬细胞是封闭的−F4/80+、肺Gr-1单核细胞−,CD-11b+和中性粒细胞Gr-1+(31日]。
统计数据
数据测试正常使用达和皮尔森综合正常测试,Kolmogorov-Smirnov测试或Shapiro-Wilk测试GraphPad棱镜5。学生的比较参数数据进行了分析t以及,单向或双向方差分析为多个组,使用Bonferroni方法与事后分析。非参数数据Mann-WhitneyU测试是用于两组比较和Kruskal沃利斯测试多个组邓恩的事后修正。统计学意义是考虑p<。05and all data are displayed as mean ± SD. All statistical analysis was performed using GraphPad Prism version 5.
R试验结果
肺泡巨噬细胞耗竭废除msc在体内的抗菌效果的模型大肠杆菌肺炎
ARDS模型,我们使用鼠标急性大肠杆菌肺炎模型,以前广泛的特点是我们组(7,10]。调查的重要性是介质的MSC体内的影响,小鼠肺泡巨噬细胞的选择性耗尽人口鼻内政府clodronate脂质体(CL)之前感染(支持信息图S2A,开通)。我们比较MSC在正常和巨噬细胞的小鼠的影响大肠杆菌感染。
值得注意的是,AM-depleted小鼠双重BALF更高的细菌菌落数与正常小鼠相比,和MSC的抗菌效果管理并不存在,而在nondepleted重大动物(图1一个)。这表明我是关键细胞介质MSC的抗菌效果的模型。
影响肺泡巨噬细胞(AM)消耗在鼠标MSC抗菌和抗炎作用大肠杆菌肺炎。(一)AM-depleted小鼠有显著提高大肠杆菌相比,BALF CFU计数nondepleted老鼠对待PBS (*,p<。05vs. control PBS, 2-way ANOVA (Bonferroni)). MSC administration had no effect on bacterial clearance in the AM-depleted group although significantly reducing大肠杆菌相比,控制小鼠CFU PBS控制(*,p=。02,年代tudent'st以及)。(B)从正常小鼠细胞因子的BALF样品。(C)细胞因子的BALF样本AM-depleted老鼠。(D-F)AM-depleted小鼠水平显著降低BALF TNF-α,il - 10、il - 6与nondepleted动物对待PBS。MSC政府没有影响细胞因子水平AM-depleted动物(*,p<。05vs. control PBS, 2-way ANOVA (Bonferroni)). MSC treatment significantly decreased TNF-α and IL-10 levels in nondepleted animals (*,p=。02and **,p=。007respectively vs. PBS treated group, Student'st以及)。(G H)BALF绝对总白细胞计数和中性粒细胞计数明显废除AM-depleted组。AM-depleted动物MSC政府没有影响,而尽管减少绝对中性粒细胞计数nondepleted老鼠(* * *,p<。001,*,p<。05vs. control PBS, 2-way ANOVA (Bonferroni)).(我)BALF蛋白显著减少涌入AM-depleted组与nondepleted老鼠接受PBS。MSC治疗显著降低BALF中蛋白质浓度nondepleted老鼠和AM-depleted动物没有影响(*,p= 0。年代tudent'st以及)。所有的数据表示为平均数±标准差(至少为每个条件n老鼠= 4 /条件)。缩写:BALF broncho-alveolar灌洗液;MSC,间充质干细胞;PBS,磷酸缓冲盐;白细胞,白细胞。
影响肺泡巨噬细胞(AM)消耗在鼠标MSC抗菌和抗炎作用大肠杆菌肺炎。(一)AM-depleted小鼠有显著提高大肠杆菌相比,BALF CFU计数nondepleted老鼠对待PBS (*,p<。05vs. control PBS, 2-way ANOVA (Bonferroni)). MSC administration had no effect on bacterial clearance in the AM-depleted group although significantly reducing大肠杆菌相比,控制小鼠CFU PBS控制(*,p=。02,年代tudent'st以及)。(B)从正常小鼠细胞因子的BALF样品。(C)细胞因子的BALF样本AM-depleted老鼠。(D-F)AM-depleted小鼠水平显著降低BALF TNF-α,il - 10、il - 6与nondepleted动物对待PBS。MSC政府没有影响细胞因子水平AM-depleted动物(*,p<。05vs. control PBS, 2-way ANOVA (Bonferroni)). MSC treatment significantly decreased TNF-α and IL-10 levels in nondepleted animals (*,p=。02and **,p=。007respectively vs. PBS treated group, Student'st以及)。(G H)BALF绝对总白细胞计数和中性粒细胞计数明显废除AM-depleted组。AM-depleted动物MSC政府没有影响,而尽管减少绝对中性粒细胞计数nondepleted老鼠(* * *,p<。001,*,p<。05vs. control PBS, 2-way ANOVA (Bonferroni)).(我)BALF蛋白显著减少涌入AM-depleted组与nondepleted老鼠接受PBS。MSC治疗显著降低BALF中蛋白质浓度nondepleted老鼠和AM-depleted动物没有影响(*,p= 0。年代tudent'st以及)。所有的数据表示为平均数±标准差(至少为每个条件n老鼠= 4 /条件)。缩写:BALF broncho-alveolar灌洗液;MSC,间充质干细胞;PBS,磷酸缓冲盐;白细胞,白细胞。
BALF的细胞因子被膜基抗体阵列(R&D)评估。在正常小鼠,MSC展示了明显的免疫调节效应(图1 b)。大多数促炎细胞因子的水平(MIP-1α、MIP-1βIL-1α,IL-1β,IL-16, MIP-2, Eotaxin, TNF-α,il - 6, KC, IL-3, IL-27, i - 309, IL-7,我,IP-10, Trem1, MCP-5,米格,IL-12p70, IL-17)下调了MSC与PBS治疗组相比,而一些抗炎介质水平(il - 4、IL-5咆哮)升高。值得注意的是,在正常小鼠il - 10水平减少了MSC治疗比PBS治疗组。我耗尽导致减少促炎细胞因子水平的主要(MIP-1α、MIP-1βIL-1α,IL-1β,IL-16, MIP-2, Eotaxin, TNF-α,il - 6, KC, IL-27, i - 309)比nondepleted PBS组治疗,表明我是这些细胞因子在这个模型的重要来源。MSC治疗AM-depleted老鼠并不是有效的恢复所观察到的细胞因子的水平在正常小鼠,这表明我是MSC的免疫调节效应的重要介质(图1 c)。的结果,证实了抗体阵列TNF-αELISA, il - 10、il - 6 (图1 d- - - - - -1 f)。同意促炎细胞因子数据,炎性细胞浸润(绝对评估总白细胞计数和中性粒细胞计数)和蛋白质后流入到肺泡空间大大降低损耗,和MSC治疗对这些参数没有影响,而它同时显著降低正常小鼠(图1克- - - - - -1我)。总的来说,这些数据强调的一个关键的角色在编排肺泡的先天免疫反应和其重要性细胞介质体内MSC治疗效果的模型。
中性粒细胞损耗不损害msc体内抗菌作用
测试如果没有MSC的抗菌效果与损耗是由于中性粒细胞招募受损,在不同的实验我们耗尽小鼠中性粒细胞的重复腹腔内注射anti-Ly6G Ab (1 a8)。
中性粒细胞减少导致显著增加细菌生长的BALF相比nondepleted老鼠和这种效应被MSC政府部分废除,表明中性粒细胞不MSC的抗菌效果的关键。(支持信息图S3A)。总体而言,类似于枯竭,中性粒细胞减少证明趋势减少肺损伤的严重性(BALF蛋白质所显示的那样)和MSC能进一步减少(1.8 1.8毫克/毫升MSC与2.6 1.9毫克/毫升PBS)(支持信息图S3B)。有趣的是,虽然不显著,BALF的tnf水平高出近50%的动物相比,在小鼠中性粒细胞减少(2.6 2.5 ng / ml PBS和1.6 1.6 ng / ml MSC耗尽组与对照组的1.5 1.4 ng / ml PBS和0.75 0.99 ng / ml MSC)(支持信息图S3C),间接支持先前的结论,巨噬细胞在这个模型中促炎细胞因子的主要来源。
MSC增加吞噬人类Monocyte-Derived小鼠肺泡巨噬细胞和巨噬细胞(MDM)
进一步调查发现巨噬细胞耗竭导致废除MSC的抗菌效果,我们测试了MSC在我体内吞噬作用的影响。
评估吞噬活动的体内,BALF和MSC治疗24小时后收获或PBS, BALF细胞与pHRodo-conjugated孵化大肠杆菌粒子通过流式细胞术和分析。是人口被确认为CD11c嗨F4/80+CD11b低Gr-1−细胞。BALF的MSC治疗组有明显大的人口比BALF吞噬我的PBS治疗小鼠(图2一个),这表明MSC治疗增强肺泡巨噬细胞吞噬能力在气道入侵的细菌。
MSC增强巨噬细胞吞噬作用。(一)在体内大肠杆菌肺炎模型,MSC治疗显著增加肺泡巨噬细胞的百分比pHrodo阳性大肠杆菌bioparticles PBS相比治疗小鼠((n= 7小鼠/条件)*,p=。01,年代tudent'st以及)。(B, C)在体外人类的MDM被感染大肠杆菌(MOI 10)有或没有直接coculture MSC(1/20比率)。(B)MSC coculture显著降低细胞外大肠杆菌再加上CFU计数(C)细胞内含量严重超标CFU (n* = 3一式三份,p<。05,**,p< . 01,学生的t以及)。数据显示为的意思 SD为每个条件。缩写:MDM, monocyte-derived巨噬细胞;MSC,间充质干细胞;PBS,磷酸缓冲盐。
MSC增强巨噬细胞吞噬作用。(一)在体内大肠杆菌肺炎模型,MSC治疗显著增加肺泡巨噬细胞的百分比pHrodo阳性大肠杆菌bioparticles PBS相比治疗小鼠((n= 7小鼠/条件)*,p=。01,年代tudent'st以及)。(B, C)在体外人类的MDM被感染大肠杆菌(MOI 10)有或没有直接coculture MSC(1/20比率)。(B)MSC coculture显著降低细胞外大肠杆菌再加上CFU计数(C)细胞内含量严重超标CFU (n* = 3一式三份,p<。05,**,p< . 01,学生的t以及)。数据显示为的意思 SD为每个条件。缩写:MDM, monocyte-derived巨噬细胞;MSC,间充质干细胞;PBS,磷酸缓冲盐。
延长这一发现更多的临床相关的人类场景和阐明这种效应的机制,我们与主人类MDM体外cocultured MSC。MSC和初级人类MDM cocultured在直接接触了4小时。在MSC,巨噬细胞增加细胞外大肠杆菌细菌杀死了80% (p= 0。n= 4)(图2 b)。反向效应观察巨噬细胞胞内CFU计数,与MSC显著增加,表明增强吞噬作用(图2 c)。
MSC转移巨噬细胞在体外和体内的线粒体
许多最近的出版物表明,线粒体从MSC转移到肺上皮和内皮细胞是MSC保护作用的重要机制在一些肺部疾病的动物模型24- - - - - -27,32]。我们假设线粒体转移可能是一种机制,通过这种机制MSC促进巨噬细胞吞噬作用。MSC与200 nM MitoTracker深红色标记线粒体染色。使用immunofluorescent成像,我们观察到,在4个小时后与MSC coculture MDM获得MSC线粒体(图3)。我们也能够想象形成细胞间胞质桥称为隧道效应纳米管(TNT) MSC与巨噬细胞染色积极MSC线粒体(图3(箭头)),这表明TNT作为传输机制。排除潜在的MitoTracker染料残余漏,MSC之前洗了三次coculture和多余的媒体测试而不是MSC(数据未显示)。我们还没有看到任何证据表明巨噬细胞吞噬作用的MSC或MDM-MSC细胞融合通过共焦和实时显微术在coculture 24小时,不包括收购MSC被巨噬细胞线粒体的可能性是由于这些机制。这些结果进一步证实了流式细胞术。几乎100%的CD45-positive MDM收购MitoRed荧光特定coculture MSC线粒体后4小时(图3 b- - - - - -3 d)。值得注意的是,MitoRed平均荧光强度(MFI) MSC (CD45负的MitoTracker+细胞)降低了大约5倍coculture相比自己MSC,表明荧光的损失由于传输(图3 e)。一个独特的CD45的存在负的MitoRed高人口coculture另外确认MSC并非由MDM吞噬。
巨噬细胞线粒体转移MSC。(一)的线粒体转移MSC人类巨噬细胞主要通过TNT-like结构(Ai)人类MDM统一表达CD45(蓝色)(还)MSC线粒体用MitoRed标记(红色)(哎)与MSC 24小时coculture, colocalization蓝色和红色,表明强劲的线粒体转移MDM MSC。网络mitochondria-positive TNT新兴的MSC和连接到一些遥远的巨噬细胞(200µm)也观察到(箭头)(图片的放大10×63;比例尺= 50µm)。(B)人口MDM单独培养,沾CD45-PE MitoRed-APC但消极。(C)人口MSC单独培养,沾MitoRed-APC CD45-PE但消极。(D)在coculture 4小时后,CD45的90%以上+MDM证明收购MitoRed荧光(APC+从MSC),表明大量的线粒体转移。(E)MSC人口MitoRed荧光强度下降后coculture MDM(蓝色柱状图)。数据代表至少有三个独立的实验。(F)大肠杆菌来华的老鼠对MitoRed-labeled MSC,象Gr-1封闭−F4/80+CD11c嗨CD11b低为他们的表达和分析MitoRed荧光在24和48小时后治疗。百分之九十三和百分之六十五的是阳性MitoRed 24和48小时,分别。图3老鼠/条件的代表。缩写:MDM, monocyte-derived巨噬细胞;MSC,间充质干细胞。
巨噬细胞线粒体转移MSC。(一)的线粒体转移MSC人类巨噬细胞主要通过TNT-like结构(Ai)人类MDM统一表达CD45(蓝色)(还)MSC线粒体用MitoRed标记(红色)(哎)与MSC 24小时coculture, colocalization蓝色和红色,表明强劲的线粒体转移MDM MSC。网络mitochondria-positive TNT新兴的MSC和连接到一些遥远的巨噬细胞(200µm)也观察到(箭头)(图片的放大10×63;比例尺= 50µm)。(B)人口MDM单独培养,沾CD45-PE MitoRed-APC但消极。(C)人口MSC单独培养,沾MitoRed-APC CD45-PE但消极。(D)在coculture 4小时后,CD45的90%以上+MDM证明收购MitoRed荧光(APC+从MSC),表明大量的线粒体转移。(E)MSC人口MitoRed荧光强度下降后coculture MDM(蓝色柱状图)。数据代表至少有三个独立的实验。(F)大肠杆菌来华的老鼠对MitoRed-labeled MSC,象Gr-1封闭−F4/80+CD11c嗨CD11b低为他们的表达和分析MitoRed荧光在24和48小时后治疗。百分之九十三和百分之六十五的是阳性MitoRed 24和48小时,分别。图3老鼠/条件的代表。缩写:MDM, monocyte-derived巨噬细胞;MSC,间充质干细胞。
测试如果线粒体转移从MSC可以检测到体内,我们被感染的老鼠大肠杆菌如之前和4小时后灌输MSC与MitoRed标记。24和48小时后感染肺收获和肺匀浆通过流式细胞术分析。总的来说,在24小时内,在先天免疫细胞肺匀浆,MSC线粒体的主要接受者被我们定义为Gr-1巨噬细胞- - - - - -F4/80+细胞(39±9%)比单核细胞(Gr-1−F4/80−CD11c−CD11b嗨)(7±3%)和中性粒细胞(Gr-1+)(4±1%)。值得注意的是,96±2%和67±7%的人口(Gr-1肺泡巨噬细胞−F4/80+CD11c嗨CD11b低)阳性MitoRed荧光分别为24和48小时(图3 f)表明有效和可持续的体内线粒体转移。
线粒体转移增强在老鼠体内肺泡巨噬细胞吞噬作用和主要人类巨噬细胞体外
确定线粒体转移在体内巨噬细胞吞噬作用的影响,老鼠对MitoRed-labeled MSC, BALF收获后24小时内感染和吞噬活性BALF使用pHRodo评估大肠杆菌粒子。肺泡巨噬细胞,获得了MSC线粒体有吞噬指数显著升高(以pHRodo MFI相比我没有MSC线粒体)MitoRed (4149±507+我与3528±470 MitoRed吗−点,意味着MFI±SD,n= 12,p= .003),这表明线粒体转移与增强吞噬能力(图4)。
通过巨噬细胞内化,间充质干细胞(MSC)线粒体提高其吞噬活性。(一)在大肠杆菌肺炎MSC (MitoRed)治疗大鼠BALF收获,肺泡巨噬细胞的吞噬活动评估使用荧光大肠杆菌通过流式细胞术bioparticles。巨噬细胞内化的MSC线粒体(水+)显示明显高于吞噬指数相比,那些没有(水)(n* * = 12日,p=。003年,学生的t以及)。这是评估pHRodo平均荧光强度的增加(MFI)。(B)孤立的线粒体取自MitoRed-treated MSC被添加到人类MDM和内化被流式细胞术证实24小时后。(C)在体外孤立的MSC线粒体分数大肠杆菌MDM显著降低感染细胞外CFU计数(n* = 3一式三份,p<。05,年代tudent'st以及)加上细胞CFU的增加(D)。缩写:MDM, monocyte-derived巨噬细胞;水户,线粒体。
通过巨噬细胞内化,间充质干细胞(MSC)线粒体提高其吞噬活性。(一)在大肠杆菌肺炎MSC (MitoRed)治疗大鼠BALF收获,肺泡巨噬细胞的吞噬活动评估使用荧光大肠杆菌通过流式细胞术bioparticles。巨噬细胞内化的MSC线粒体(水+)显示明显高于吞噬指数相比,那些没有(水)(n* * = 12日,p=。003年,学生的t以及)。这是评估pHRodo平均荧光强度的增加(MFI)。(B)孤立的线粒体取自MitoRed-treated MSC被添加到人类MDM和内化被流式细胞术证实24小时后。(C)在体外孤立的MSC线粒体分数大肠杆菌MDM显著降低感染细胞外CFU计数(n* = 3一式三份,p<。05,年代tudent'st以及)加上细胞CFU的增加(D)。缩写:MDM, monocyte-derived巨噬细胞;水户,线粒体。
据报道之前,孤立的MSC线粒体被癌细胞容易内化,保持细胞内的功能后人工转移和扮演一个角色在改变癌细胞生物能学27]。我们决定使用分离MSC线粒体确认他们在体外巨噬细胞吞噬作用的角色。MSC线粒体被孤立和添加到人类MDM文化与生活刺激前24小时大肠杆菌在以往的实验。证实了内化分离线粒体的巨噬细胞流式细胞术(图4 b)。孤立的线粒体与MDM导致细胞外下降60%大肠杆菌CFU MDM相比,模仿的影响MSC coculture(77%减少细胞外CFU) (图4摄氏度)。一致,增加分离线粒体导致细胞内的增加大肠杆菌相比,CFU计数,类似于MSC coculture独自MDM建议改进的吞噬作用(图4 d)。伊斯兰教等人表明,形成缝隙连接通过Connexin-43 cell-contact-dependent线粒体转移所必需的MSC肺泡上皮细胞(24]。在体外coculture我们观察到线粒体是通过TNT转移到MDM形成细胞与巨噬细胞的联系。26岁的差距,一个特定抑制剂Connexin-43缝隙连接形成,并没有改变形成TNT-macrophage联系人或线粒体转移率(数据未显示),排除参与Connexin-43缝隙连接。我们后来猜测,阻断MSC将废除TNT形成的转移。细胞松弛素B的摩尔浓度报道阻止TNT的形成而不影响内吞作用和吞噬作用被用来阻止TNT形成MSC之前(27,33,34]。预培养的MSC 500纳米细胞松弛素B导致抑制TNT形成和实质细胞形态学的变化图5线粒体转移),然而,虽然那么密集,仍明显(图5,5 b)。这将表明,TNT调解转移只是部分通过细胞和巨噬细胞也获得MSC线粒体contact-independent机制。
![抑制MSC隧道形成纳米管(TNT)通过预处理细胞松弛素B部分街区线粒体转移不同影响MSC MDM的调制。(A)共焦显微镜显示正常的梭形形态coculture MitoRed MSC(红色)的MDM (CD45 +蓝)和TNT线粒体转移是显而易见的(图像被放大的10×63;比例尺= 50µm)。细胞松弛素B(500海里)MSC预处理出现圆形和TNT不再是可见的,但是线粒体转移仍然发生colocalization如图所示的染色。(B)与细胞松弛素B Coculture MDM MSC预处理导致大约50%废除MitoRed MFI的巨噬细胞(* p <。05年,Mann-Whitney U测试)。(C, D)线粒体呼吸的人类巨噬细胞和MSC和耗氧速率测量使用海马(OCR)技术。巨噬细胞线粒体功能分析在coculture有或没有人类存在与否的MSC寡霉素,FCCP和鱼藤酮/抗霉素A ATP-linked呼吸与质子泄漏。与未经处理的但不是细胞松弛素B Coculture MSC预处理水平显著增强的MDM线粒体基础呼吸和线粒体ATP的营业额(n = 5 - 6、* p <。05年,Mann-Whitney U测试)。(E) MSC预处理细胞松弛素B显著恢复细胞的可行性MDM后大肠杆菌感染(* * * p <。001年与MDM,方差分析(Bonferroni))。(F)的完整和细胞松弛素B MSC预处理coculture显著降低LPS-induced TNF-α水平培养基(厘米)(* p <。* * 05,p <。01,* * *, p < .001 vs. MDM+LPS, **, p < .05 vs. MDM, ANOVA (Bonferroni). (G) Extracellular E. coli CFU were significantly decreased in coculture with untreated but not Cytochalasin B pretreated MSC compared to MDM alone (*, p < .05, **, p < .01 vs. MDM, ANOVA [Bonferroni]). Data shown as mean ± SD, n = 3–4 in triplicate for each condition. Abbreviations: MDM, monocyte-derived macrophages; MFI, median fluorescence intensity; MSC, mesenchymal stem cells.](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/stmcls/34/8/10.1002_stem.2372/2/m_stmcls_34_8_2210_f5.jpeg?Expires=1653677719&Signature=lNgPklETBrjIUMiKgbGfel24sdIEbWqsG3YEa-BM3DIvHWd8yyTVtWC5Dfcy~eRpPgomL928q6QeQxPQYb9-xAEyYlytv2C8dAOvoyeCfrE~9sh9Mde-boWj5wGheVOBUPti0G9317M5x8CJMMWoR-6~pEd0fHvdhxYb~~qVKTDWTd47hElLK4wQXxakaMhpNaIoFod~qO5XcKRh42diceM9enf6WKBHmB-LZhByzzrHJ5xuQzOLiJboAqXQW~bq-8mHvrYfHYQL49zyLaZbiTCk8-lwXHgIQ9XJtBIE0ZoBn-l-wLLD564MAXeVA18V8ct96sML8C01ZDaTS5McCQ__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
抑制MSC隧道形成纳米管(TNT)通过预处理细胞松弛素B部分街区线粒体转移不同影响MSC MDM的调制。(一)共焦显微镜显示正常的梭形形态coculture MitoRed MSC(红色)的MDM (CD45 +蓝)和TNT线粒体转移是显而易见的(图像被放大的10×63;比例尺= 50µm)。细胞松弛素B(500海里)MSC预处理出现圆形和TNT不再是可见的,但是线粒体转移仍然发生colocalization如图所示的染色。(B)Coculture MDM细胞松弛素B MSC预处理导致大约50%废除MitoRed MFI的巨噬细胞(*,p<。05,米ann-WhitneyU测试)。(C, D)人类巨噬细胞和MSC的线粒体呼吸耗氧速率测量使用海马(OCR)技术。巨噬细胞线粒体功能分析在coculture有或没有人类存在与否的MSC寡霉素,FCCP和鱼藤酮/抗霉素A ATP-linked呼吸与质子泄漏。与未经处理的但不是细胞松弛素B Coculture MSC预处理的线粒体水平显著增强的MDM基底呼吸和线粒体ATP营业额(n= 5 - 6,*,p<。05,米ann-WhitneyU测试)。(E)MSC预处理细胞松弛素B显著恢复细胞的可行性MDM职位大肠杆菌感染(* * *,p<。001vs. MDM, ANOVA (Bonferroni)).(F)建立完整和细胞松弛素B MSC预处理coculture显著降低LPS-induced TNF-α水平培养基(厘米)(*,p<。05,**,p<。01,***,p<。001vs. MDM+LPS, **,p<。05vs. MDM, ANOVA (Bonferroni).(G)细胞外大肠杆菌CFU明显减少与未经处理的但不是细胞松弛素B coculture MSC预处理相比单独MDM (*,p<。05,**,p<。01vs. MDM, ANOVA [Bonferroni]). Data shown as mean ± SD,n为每个条件= 3 - 4一式三份。缩写:MDM, monocyte-derived巨噬细胞;小额信贷机构,平均荧光强度;MSC,间充质干细胞。
抑制MSC隧道形成纳米管(TNT)通过预处理细胞松弛素B部分街区线粒体转移不同影响MSC MDM的调制。(一)共焦显微镜显示正常的梭形形态coculture MitoRed MSC(红色)的MDM (CD45 +蓝)和TNT线粒体转移是显而易见的(图像被放大的10×63;比例尺= 50µm)。细胞松弛素B(500海里)MSC预处理出现圆形和TNT不再是可见的,但是线粒体转移仍然发生colocalization如图所示的染色。(B)Coculture MDM细胞松弛素B MSC预处理导致大约50%废除MitoRed MFI的巨噬细胞(*,p<。05,米ann-WhitneyU测试)。(C, D)人类巨噬细胞和MSC的线粒体呼吸耗氧速率测量使用海马(OCR)技术。巨噬细胞线粒体功能分析在coculture有或没有人类存在与否的MSC寡霉素,FCCP和鱼藤酮/抗霉素A ATP-linked呼吸与质子泄漏。与未经处理的但不是细胞松弛素B Coculture MSC预处理的线粒体水平显著增强的MDM基底呼吸和线粒体ATP营业额(n= 5 - 6,*,p<。05,米ann-WhitneyU测试)。(E)MSC预处理细胞松弛素B显著恢复细胞的可行性MDM职位大肠杆菌感染(* * *,p<。001vs. MDM, ANOVA (Bonferroni)).(F)建立完整和细胞松弛素B MSC预处理coculture显著降低LPS-induced TNF-α水平培养基(厘米)(*,p<。05,**,p<。01,***,p<。001vs. MDM+LPS, **,p<。05vs. MDM, ANOVA (Bonferroni).(G)细胞外大肠杆菌CFU明显减少与未经处理的但不是细胞松弛素B coculture MSC预处理相比单独MDM (*,p<。05,**,p<。01vs. MDM, ANOVA [Bonferroni]). Data shown as mean ± SD,n为每个条件= 3 - 4一式三份。缩写:MDM, monocyte-derived巨噬细胞;小额信贷机构,平均荧光强度;MSC,间充质干细胞。
细胞松弛素B的MSC预处理导致附近MitoRed平均荧光强度减少50% (MFI)在MDM相比MDM coculture与未经处理的MSC(9300±2068和5240±2643 MDM MitoRed MFI平均数±标准差,p= .028)(图5 b)。
进一步调查如果转移到线粒体功能,我们对巨噬细胞线粒体呼吸和线粒体ATP周转使用海马技术(35]。值得注意的是,与MSC coculture导致显著增加和健壮的MDM线粒体基础呼吸率和线粒体ATP营业额以耗氧速率(OCR)。Coculture细胞松弛素B MSC预处理废除这一效应(图5度,5 d),确认TNT调节线粒体功能的转移,这个过程可以被细胞松弛素B预处理。
与MDM coculture,细胞松弛素B MSC预处理能够拯救MDM大肠杆菌全身的细胞死亡在一个类似的程度上参与MSC (50 - 40%) (图5 e),保留了重要的抑制能力LPS-induced TNF-α分泌到MDM,强有力地虽然低于未经处理的MSC (图5 f)。这提供了额外的证据,MSC的分泌功能没有明显影响细胞松弛素B预处理。然而,细胞松弛素B MSC预处理完全失去能力增强细菌清除率与未经处理的MSC(见图5克),这表明部分废除线粒体转移负责MSC对体外巨噬细胞吞噬作用的影响。
因此,线粒体转移通过TNT导致改进MDM的MDM吞噬作用可能通过增强线粒体功能和ATP营业额。重要的是,通过细胞松弛素B预处理我们能够选择性地阻止MSC对巨噬细胞吞噬作用的影响和生物能疗法在不影响其抗炎作用。
部分抑制线粒体转移的预防TNT形成MSC废除MSC的抗菌效果大肠杆菌肺炎
延长这一发现体内设置,我们处理与未经处理的小鼠,细胞松弛素B MSC预处理和MSC孤立的线粒体。的MSC预处理细胞松弛素B完全废除的抗菌效果MSC BALF和肺匀浆导致几乎增加两倍大肠杆菌CFU BALF中,类似于效应与损耗(无花果。1,6,6 b)。这将表明的重要性cell-contact-dependent线粒体转移MSC体内的抗菌效果。MSC的抗菌效果不是由政府完成的MSC孤立的线粒体,表明线粒体完整MSC需要有效的转移可能功能整合到受体细胞体内。
抑制隧道纳米管形成的MSC废除MSC的抗菌效果大肠杆菌肺炎。的MSC预处理细胞松弛素B抑制治疗MSC BALF中细菌清除率的影响(一)和肺匀浆(B)。管理MSC线粒体分数没有明显影响细菌BALF中负担相比PBS组(BALF中*,p<。05米年代Cvs. PBS, Kruskal Wallis test, in lung homogenate *,p<。05米年代Cvs. CytoB, Kruskal Wallis test, PBS vs. MSC, Student'st以及,n= 3 - 5老鼠每组)。数据显示为的意思 SD为每个条件。缩写:BALF broncho-alveolar灌洗液;MSC,间充质干细胞。
抑制隧道纳米管形成的MSC废除MSC的抗菌效果大肠杆菌肺炎。的MSC预处理细胞松弛素B抑制治疗MSC BALF中细菌清除率的影响(一)和肺匀浆(B)。管理MSC线粒体分数没有明显影响细菌BALF中负担相比PBS组(BALF中*,p<。05米年代Cvs. PBS, Kruskal Wallis test, in lung homogenate *,p<。05米年代Cvs. CytoB, Kruskal Wallis test, PBS vs. MSC, Student'st以及,n= 3 - 5老鼠每组)。数据显示为的意思 SD为每个条件。缩写:BALF broncho-alveolar灌洗液;MSC,间充质干细胞。
细胞Contact-Independent线粒体转移
虽然TNT-mediated线粒体转移至关重要的MSC影响吞噬作用在体外和体内,我们也探讨exosome-mediated线粒体转移的重要性。MSC与MitoTracker prelabeled红色和与人类MDM cocultured Transwell 1/5比例的无触点coculture系统。更高的MSC数量实施补偿的距离液必须通过插入到MDM。24小时后,21.7±5.9%的巨噬细胞获得MSC线粒体coculture这是增加到55.1±16.8%使用MSC条件培养基(图7)。这建议有效转移虽然不如程度的有效转移细胞cocultured时直接接触。与先前的研究一致,MSC在无触点coculture显著增强巨噬细胞吞噬的比例与LPS刺激时量化使用pHRodo粒子(图7 b),和吞噬巨噬细胞内化MSC线粒体证明吞噬指数高于那些没有线粒体(图7 c)。
![线粒体转移在MSC MDM通过无触点依赖机制。MDM是cocultured MSC-CM或MSC(使用MitoRed) Transwell系统没有细胞接触24小时有限合伙人的存在。(A)线粒体转移到MDM的程度是衡量流式细胞术(n = 3 - 5 /组* p <。* * 05,p <。01,* * *,p<。001,一个NOVA [Bonferroni]) (B) The MDM were also given pHRodo particles to quantify phagocytosis (n = 5/group, *, p < .05, ANOVA (Bonferroni)). (C) Phagocytic MDM were divided into two groups, with and without internalization of MSC mitochondria, and their phagocytic indexes were determined by median fluorescence intensity (MFI) (n = 5/group *, p < .05, Student's t-test). Abbreviations: CM, culture medium; MDM, monocyte-derived macrophages; MSC, mesenchymal stem cells.](https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/stmcls/34/8/10.1002_stem.2372/2/m_stmcls_34_8_2210_f7.jpeg?Expires=1653677719&Signature=E-GdgKwmJGgsUwsRAjoce~P6QIF51jk849zhtjLcj38JBnS24CCZyKKzXfcSywfMRfdIQzo5OK9eFp3PUOdolzPUfXNO~ewF4zVmxx0NmVkqk02AvZI-llicthK-VrsohmAjNkeRGG3X73zpbUd5EeYC4motyR~TRMIHNdqydL~TOF6DDEBPIZEnXW7ZkuKjz8PGnoVj0~vE7VXpSQVr5aNMCB4BKdd7xnDuE4BIcuogRiw99qXuuPD6v-7YyXaG6H19Qn-iBCs36oAhPKVeFM8oDHx24vo6sccADDdi34elHN~Y77X4kOY8jnXk9QSavVLkjLihjT7c8AbRDNKT0Q__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA)
线粒体转移在MSC MDM通过无触点依赖机制。MDM是cocultured MSC-CM或MSC(使用MitoRed) Transwell系统没有细胞接触24小时有限合伙人的存在。(一)线粒体转移到MDM的程度是衡量流式细胞术(n= 3 - 5 /组*,p<。05,**,p<。01,***,p<。001,一个NOVA [Bonferroni])(B)MDM也给pHRodo粒子量化吞噬作用(n* = 5 /组,p<。05,一个NOVA (Bonferroni)).(C)吞噬MDM分为两组,有或没有MSC线粒体的内化,吞噬指数测定平均荧光强度(MFI) (n= 5 /组*,p<。05,年代tudent'st以及)。缩写:厘米,培养基;MDM monocyte-derived巨噬细胞;MSC,间充质干细胞。
线粒体转移在MSC MDM通过无触点依赖机制。MDM是cocultured MSC-CM或MSC(使用MitoRed) Transwell系统没有细胞接触24小时有限合伙人的存在。(一)线粒体转移到MDM的程度是衡量流式细胞术(n= 3 - 5 /组*,p<。05,**,p<。01,***,p<。001,一个NOVA [Bonferroni])(B)MDM也给pHRodo粒子量化吞噬作用(n* = 5 /组,p<。05,一个NOVA (Bonferroni)).(C)吞噬MDM分为两组,有或没有MSC线粒体的内化,吞噬指数测定平均荧光强度(MFI) (n= 5 /组*,p<。05,年代tudent'st以及)。缩写:厘米,培养基;MDM monocyte-derived巨噬细胞;MSC,间充质干细胞。
Discussion
本研究的主要发现是,(1)小鼠模型的MSC的抗菌效果大肠杆菌全身的肺炎是依赖于肺泡巨噬细胞;(2)MSC线粒体转移他们的巨噬细胞在体外和体内;(3)从MSC线粒体转移到主要人类MDM是至少部分介导通过TNT-like结构;(4)从MSC线粒体转移到巨噬细胞能提高巨噬细胞的线粒体功能和ATP营业额体外和增强巨噬细胞吞噬能力在体外和体内,(5)从MSC TNT-mediated线粒体转移到肺泡巨噬细胞是一种重要的机制,MSC体内的抗菌效果。
被认为扮演一个重要角色在清除细菌感染的空域由空气中的微生物吞噬作用和通过编排炎症反应。虽然有益MSC治疗在动物模型的影响大肠杆菌肺炎是有据可查的7,10,20.,36)的作用是作为MSC的多孔介质影响没有直接解决。因此,在本研究老鼠耗尽我的在感染前clodronate-containing脂质体滴注法大肠杆菌K1。我消耗水平的差别导致了对这些重要的促炎细胞因子以及减少炎性细胞(中性粒细胞和单核细胞)的招聘到空域,与细菌清除率明显障碍在24小时后感染。值得注意的是,MSC的抗菌效果是完全废除是损耗(图1一个)。测试如果MSC抗菌效果的损失可能是一个妥协的结果中性粒细胞招募,我们耗尽小鼠中性粒细胞,发现虽然嗜中性粒细胞损耗导致显著增加BALF细菌负担,MSC治疗部分废除这一效应(支持信息图3)。总的来说,这些发现表明,我但不是中性粒细胞的MSC的抗菌效果至关重要大肠杆菌肺炎模型。
潜在的机制之一的MSC可以提高细菌间隙是提高宿主吞噬细胞吞噬并杀死入侵微生物的能力。我们以前报道,MSC改善外周血单核细胞的吞噬能力模型铜绿假单胞菌腹膜炎(9还有我的模型大肠杆菌全身的肺炎体外肺灌注人类准备(11]。这些研究结果进一步证实了Devaney et al。36),这表明在大鼠MSC有益的效果大肠杆菌肺炎与单核细胞和巨噬细胞的吞噬活动,也增加了Monsel et al。20.),证明了MSC或MSC-derived微泡基本人类单核细胞吞噬能力提高。同意这些发现,我们现在的工作表明,MSC政府与数量显著增加的吞噬我控制小鼠相比图2一个)。这些数据进一步证实了体外,与MSC coculture导致主要的能力显著改善人类MDM消除细菌细胞外(图2 b)。有趣的是,大厅等。18)报道,鼠标的抗菌效果MSC在盲肠的结扎和穿刺脓毒症模型是通过改进嗜中性粒细胞的吞噬作用,介导的中性粒细胞损耗是不利于MSC的有利影响。然而,在我们的研究中我们不能发现任何差异与MSC(中性粒细胞吞噬作用9),这些不一致可能是由于不同的模型使用的我们的团体以及功能性质的差异人类和老鼠MSC。
人们普遍认为旁分泌因子的分泌是MSC作用的主要机制之一(37]。尽管在许多研究据报道,MSC细胞产品(条件培养基或液)能够概括效应细胞(20.,22,23,38- - - - - -40),也有报道显示,检查参与组成分泌腺MSC并不有效36还是不那么有效完整的细胞疗法(41),这表明cell-contact-dependent的作用机制。直接从MSC cell-contact-dependent线粒体转移到肺上皮和内皮细胞被报道为MSC有利影响的一个重要机制在一些肺部疾病的临床前动物模型20.,24- - - - - -26]。MSC将线粒体的先天免疫细胞通过cell-contact-dependent机制尚未被研究过。在我们的实验中,我们发现,MSC具有深刻的能力将线粒体的巨噬细胞在体外和体内图3)。此外,我们通过TNT-like结构可视化,转移发生由MSC。TNT是Rustom等人于2004年第一次描述了42作为一种新的信息交流机制。此后许多报告表明,TNT便利交流信号分子和细胞器,包括线粒体细胞之间的连接(43- - - - - -46]。线粒体的TNT-mediated机制从MSC转移到支气管上皮细胞被证明占MSC有利影响哮喘和慢性阻塞性肺病的临床前模型(26]。此外,Miro1马达蛋白已被证明在中介转移发挥重要作用的肌动蛋白纤维在TNT (25]。伊斯兰教et al ., 2012年报道,MSC线粒体捐赠肺泡上皮细胞,Connexin-43基于MSC和接受者之间缝隙连接细胞被要求(24]。然而,在我们的工作阻止Connexin-43缝隙连接形成的差距26的数量没有影响细胞接触MSC-derived TNT和巨噬细胞线粒体转移率。
符合现有文献[23,24,26),我们发现TNT-mediated线粒体转移增强巨噬细胞生物能疗法(基础呼吸和线粒体ATP营业额)确认转线粒体功能(图5度,5 d)。
更重要的是,我们注意到,我获得了MSC线粒体显示更高的体内吞噬活动(图4)。进一步测试我们的假设,线粒体捐赠将增强巨噬细胞的吞噬活动,我们孤立的MSC的线粒体分数,并添加了巨噬细胞在文化。一些报告表明,孤立的线粒体可以直接由细胞内化,纳入内生线粒体网络和有助于生物能量学剖面的变化以及功能性质的受体细胞,不仅在体外,而且体内(48,49]。在我们的工作中,除了孤立的MSC线粒体分数的体外显著提高巨噬细胞吞噬活动的影响类似于MSC coculture (图4摄氏度,4 d)。通过流式细胞术观察外源性线粒体的内化成巨噬细胞(图4 b)。
人为的分离线粒体的内化机制还未可知。可以推测,它将不同于自然转移过程发生当线粒体是通过TNT或液,可能导致受体细胞不同的功能结果。这是这种方法的一个局限的增益函数的方法来测试MSC线粒体在这个效应的重要性。
有趣的是,当MSC TNT的形成是由细胞松弛素B,抑制线粒体转移并不是完全废除,建议参与细胞接触独立的机制很可能通过微泡释放MSC (图5,5 b)。我们已经表明,即使MSC和MDM是cocultured没有接触,MDM做获得MSC线粒体虽然影响程度大大低于直接观察到细胞接触。这种转移是增加吞噬能力(图7)。MSC的能力释放mitochondria-containing微泡已经报道了伊斯兰教et al。(24)和进一步证实Phinney et al。(23),他们证明了MSC外包部分线粒体去极化的巨噬细胞通过分泌细胞外被承兑人巨噬细胞吞噬小泡。这有助于提高巨噬细胞生物能学而另一种类型的MSC breakefield同时抑制巨噬细胞激活toll样受体信号的抑制。这种现象可以解释MSC微泡的能力提高单核细胞吞噬作用,所示Monsel et al。20.),还提供了一个额外的解释独立MSC对巨噬细胞免疫调节效应的线粒体转移捐赠,我们看到在我们的研究中。
最后,部分堵塞预培养的MSC 500海里的线粒体转移细胞松弛素B导致完全废除MSC影响巨噬细胞生物能疗法和细胞外间隙细菌虽然不影响MSC pro-survival和体外抗炎属性(图5)。重要的是,治疗小鼠体内细胞松弛素B MSC预处理展示(5倍到10倍)明显高于细菌性负担BALF所表现出的肺和肺匀浆大肠杆菌CFU计数比正常小鼠获得MSC (图6,6 b),类似于效果与损耗(图1一个)。值得注意的是,虽然我们观察到线粒体的一部分分离MSC在文化导致巨噬细胞内化和改善体外吞噬作用,政府的孤立的线粒体老鼠体内细菌清除率(没有任何影响图6)。一个可能的解释是,这种影响体内所需的剂量是不同于体外的场景。同时,我们没有测试这些外生线粒体的分布在肺,有可能在给药途径线粒体不均匀分布,但都集中在一个小区域,防止他们吸收由我从遥远的肺泡和静脉给药途径可能更有利。
最近发表的一篇论文Braza et al。50)报道称,在一所房子尘埃mite-induced哮喘模型MSC被我吞噬导致M2表型转换和减轻炎症。在目前的研究中我们已经测试了的可能性MSC在体外吞噬了人类的mdm实时成像和吞噬的共焦显微镜检查,没有发现任何证据或细胞融合在coculture多达72小时。一些可能会吞噬凋亡MSC是体内从而约占线粒体转移,然而MSC抗菌效果的损失在抑制TNT-like结构表明主动线粒体运输而不是被动吞噬作用的重要性是MSC调制的这个模型。
本研究有局限性。本研究重点是MSC线粒体转移到巨噬细胞的重要性作为一个小说的MSC体内的抗菌效应机制。我们这里不报告转移其他巨噬细胞功能的影响(例如,细胞因子和趋化因子的分泌或极化);这是正在进行的工作的主体。问题仍然是关于MSC线粒体的机制促进巨噬细胞吞噬作用。线粒体是涉及高能磷酸盐的合成,调节钙的商店,激活细胞信号传导通路从而影响细胞命运以及穿梭于遗传物质。线粒体转移,这是合理的补充ATP池中正在迅速耗尽巨噬细胞细胞骨架重组过程中吞噬作用。尽管我们已经表明,线粒体转移增强巨噬细胞生物能疗法,我们没有证明这是更积极的吞噬作用的直接原因;这将需要更多的深度调查利用MSC与线粒体功能失调。
Conclusion
总之,MSC线粒体转移他们的巨噬细胞在体外和体内。线粒体捐赠结果增强巨噬细胞的吞噬作用可能通过改善生物能疗法和提出了一个新颖的机制MSC在条件复杂的抗菌效果的细菌感染。
一个cknowledgments
这项工作是由英国医学研究理事会/ L017229/1先生(理应)NHLBI HL51854 (MAM)。从事这项工作的一些材料提供的德州农工大学健康科学中心大学医学院再生医学研究所Scott &白色NCRR美国国立卫生研究院的资助,格兰特# P40RR017447。
一个uthorContributions
M.J.:Conception and design, collection and assembly of data, data analysis and interpretation, manuscript writing. T.M.: Collection and assembly of data, data analysis and interpretation, manuscript writing. D.D.: Collection of data, technical assistance with animal studies. D.M.: Provision of the study material, manuscript writing. M.M.: Data analysis and interpretation, manuscript writing, financial support. A.K.: Data analysis and interpretation, manuscript writing. C.O.: Data analysis and interpretation, manuscript writing, provision of the study material. A.D.K. Conception and design, financial support, collection and assembly of data, data analysis and interpretation, manuscript writing, final approval of the manuscript.
Disclosure的P这种不Conflicts的我兴趣的
作者表示他们没有潜在的利益冲突。
References
