气管干细胞梗塞部位移植替代疗法:教训同情使用应用GMP-Compliant医学组织工程gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

气管置换术治疗终末期的呼吸道疾病仍然是一个难以达到的目标。利用组织工程气管有同情心的用例表明,这种方法是一种可行的选择。在这里,一个干梗塞部位,脱细胞组织工程气管移植是用于一个女孩与一个富有同情心的基础关键传统重建技术失败后气管狭窄。贪污代表第一梗塞部位气管移植生产全面良好生产规范(GMP)标准。我们报告重要的临床前和临床数据的情况下,结束在收件人的死亡。早期结果令人鼓舞,但急性事件,假设是一个胸内的流血,突然引起气道阻塞post-transplantation 3周,导致她死亡。我们详细的临床事件和确定优先领域改进未来的移植。特别是,我们提倡使用在最初几个月post-implantation支架。这种情况下强调固有的负面结果在临床翻译困难,临床前体内模型不能复制复杂临床遇到的场景。实际困难提供GMP移植凸显了需要完善协议第一阶段临床试验。gydF4y2Ba

在这里,一个干梗塞部位,脱细胞组织工程气管移植是用于一个女孩与一个富有同情心的基础关键传统重建技术失败后气管狭窄。我们报告一位富有同情心的用例气管组织工程使用梗塞部位,脱细胞捐赠气管。青少年接受后严重狭窄传统重建技术失败了。完整的良好生产规范标准的情况下涉及应用程序创建一个制造先进的医疗产品用于移植。gydF4y2Ba

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我gydF4y2BantroductiongydF4y2Ba

先天性气管狭窄少见,导致严重气道狭窄是由于完整的气管环的存在。手术方法与补丁气管成形术增加气管但长期经常失败,因为再狭窄的gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。在过去的十年中,幻灯片气管成形术已成为最主要的治疗方法,因为它极大地提高了发病率和死亡率比其他外科重建技术(gydF4y2Ba2、3gydF4y2Ba]。这些重建手术的进步,然而,尽管仍有儿童、青少年和成年人与先进的疾病,传统的治疗和为谁只有辩解是可能的gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。因此,这些稀有的其他策略,有时,危及生命的情况下是必要的。gydF4y2Ba

气管替代疗法已被建议作为解决严重的晚期疾病患者(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。儿童与尸体气管重建同种移植是可行的,在短暂的阶段(颈)疾病,短期,中期结果令人鼓舞。目前还不清楚如果结果同样适用于长段疾病(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。另外,同种移植有采购困难,目前还未能有效。异体移植术还包括长期免疫抑制与随之而来的风险。组织工程移植物的使用基于合成支架提供了理论上的优势,虽然第一次的结果已经证明了一般令人失望的(gydF4y2Ba7、8gydF4y2Ba),部分原因是由于其未能与接受者集成组织。与此同时,基于脱细胞支架结构的组织工程移植物一直在考虑(gydF4y2Ba9 - 11gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

临床应用的组织工程化中空器官构造已经被一些团体报道。安东尼和他的同事们部分重建与collagen-polyglycolic酸支架播种与膀胱移行细胞和肌肉细胞扩大在文化从活组织检查gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。虽然最初的报道一直在鼓励,更大的临床试验中断是由于副作用的发生率高(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。气道结构基于脱细胞(“生物”)和合成支架在成人移植的原因有同情心与呼吸道上皮细胞和分化不定地间充质基质细胞(msc)。然而,协议差别很大,产品没有生产先进药物良好生产规范(GMP)合规(英国;cGMP在美国),结果报道是有限的,这些情况下的某些方面是有争议的gydF4y2Ba9、14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

最初的报道表明乐观为重建航空组织工程方法,但数据长期结果仍然稀缺。第一个成人移植自体骨髓MSC-derived软骨细胞和自体呼吸道上皮梗塞部位脱细胞支架5年随访报告(gydF4y2Ba10、14gydF4y2Ba]。我们之前报道的四年随访结果孩子移植与自体梗塞部位组织工程构造,结合使用外源性生长因子时的过程(11、15)。gydF4y2Ba

在这里,我们描述GMP方法开发生产脱细胞与自体气管支架的细胞作为一种先进的医学专门为同情使用广泛的多学科小组讨论后在一个十几岁的女孩。我们描述的不良临床结果为了增加建设性地发表文献有关组织工程气管和使用我们的经验为未来的研究提供假设和强调需要透明的,正式的临床试验。我们认为至关重要的是,所有这些相关的情况下达到读者。gydF4y2Ba

米gydF4y2Baaterials和gydF4y2Ba米gydF4y2Ba治疗gydF4y2Ba

收件人gydF4y2Ba

一个女孩,天生一个左肺和先天性长段气管狭窄(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),进行了气管成形术与横向肋软骨移植修复2个月大的时候。手术后,未能extubate和持续的软化促使立即插入balloon-expandable不锈钢支架(Palmaz支架,心脏的公司,迈阿密湖泊、FL,gydF4y2Bahttps://www.cordis.com/en_us.htmlgydF4y2Ba;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)。这使得她气管切开轻度间歇正压通气支持。积极主动的管理与内镜监测和球囊扩张支架进行必需的。在4岁的时候,孩子接受了心包修补气管成形术后由于复发性狭窄串行气球扩张失败。不完整切除支架导致复发性肉芽组织形成和再狭窄修复气管的长度,这是保守管理(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC和gydF4y2Ba1gydF4y2BaD)。最后,一个气管造口术是必要的,和孩子成为上下两层的正压通气(BiPAP)晚上ventilation-dependent。gydF4y2Ba

在15岁的时候,她遭遇了家庭呼吸停止,但成功地复苏。临床恶化,加上潜力呼吸逮捕,促使临床团队考虑气管替代疗法在缺乏令人满意的传统重建选项。这个孩子被称为和评估大奥蒙德街儿童医院(天啊;伦敦,英国)由多学科(气管)团队授权为儿童气管重建英国专家委员。多学科团队是如前所述gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),附加表示从临床医生和科学家熟悉移植和细胞制造协议。是考虑替代策略,包括缓解和保存同种移植替代。考虑到集团的经验和成功与自体干细胞移植气管(gydF4y2Ba11日15gydF4y2Ba),组织工程构建提供孩子和她的家人。恶化的时间进程允许采购的捐赠气管GMP-compliant去细胞自体msc和伴随的扩张,上皮细胞细胞疗法完全牌照的设施(中心细胞,基因和组织疗法,皇家自由医院和伦敦大学学院、伦敦、英国)为自体生物反应器体外再播。经过进一步的多学科的讨论,临床伦理委员会批准,天哪,在人体组织机关许可(HTA)和药物和保健产品监管署(MHRA,英国相当于美国食品和药物管理局(FDA)),孩子,家庭,和临床团队同意与充分知情同意的过程。这个过程发生在2012年2月在天啊。gydF4y2Ba

移植前的准备gydF4y2Ba

气管移植是一个脱细胞同种异体气管从尸体供体获得和播种体外细胞culture-expanded骨骨髓来源msc和nasal-derived上皮细胞。在欧盟,包含人类细胞支架作为组织工程先进的治疗药品监管(ATMPs)。GMP-compliant的主要挑战是实现生产过程,以满足监管要求。这个产品是生产的GMP合规性和植入作为未经授权发布医学在英国的生产授权下MHRA根据预定义的发布标准(见补充在线数据)。gydF4y2Ba

气管支架是来自捐赠者通过英国国家移植服务(国家卫生服务血液和移植组织服务)在HTA许可下,捐赠者是筛查潜在transplant-transmissible疾病按照欧盟规定。捐赠气管匹配等正常气管直径和采购,长度将超过主机病变段。gydF4y2Ba

去细胞协议应用于洗涤剂酶处理涉及的气管在真空压力下(如前所述)(gydF4y2Ba17、18gydF4y2Ba),但使用等效,GMP-compliant去细胞试剂。简单地说,组织解冻至室温在24小时。去细胞在一个不锈钢Ricordi下进行真空室与港口和压力表测量真空(1托)。去细胞的步骤都是在真空下进行轨道振动器在140 rpm除非另有说明(补充网络图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。气管是孵化洗涤剂溶液中含有0.25%的钠脱氧胆酸盐,0.25% tritonx - 100汉克的平衡盐溶液在24小时37°C。其次是清洗步骤,由两个周期的清洗液2小时37°C和进一步孵化44小时在4°C一个起伏的轨道振动器在20 rpm。气管被孵化在核酸酶解37°C 24小时,其次是清洗步骤,如上所述。核酸酶溶液清洗步骤重复一次,和脚手架产品暂时存储在威斯康辛大学冷存储解决方案之前在4°C细胞移植。gydF4y2Ba

自体msc移植前来源于骨髓液生产和扩大通过四个细胞通道获得足够的msc对质量控制和脚手架播种(补充网络图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。同样,呼吸道上皮细胞从粘膜活检获得来自鼻中隔和下鼻甲和扩展作为外植体的文化。细胞被播种到支架移植前在生物反应器(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个和gydF4y2Ba2gydF4y2BaB;在网上看到补充数据)。gydF4y2Ba

气管置换手术gydF4y2Ba

与全身麻醉诱导后,重做胸骨切开术。动员的附着单左肺被要求获得访问右侧心。管子的主动脉和下腔静脉后,低温心肺旁路与全肝素化开始。气管是人口附着相邻结构,包括主动脉。这是动员彻底切除气管造口术1厘米内和船底座上方1厘米(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba的部分)。迁移通过气管支架壁意味着它是不可能完全消除后壁的金属支架。的近端和远端更换气管(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2BaB和gydF4y2Ba3gydF4y2BaC)与中断水平网状床垫缝合线(4/0 PDS II)和测试的空气泄漏之前断奶旁路(图。gydF4y2Ba3gydF4y2BaD)。腹腔镜腹部的探索显示网膜不足以形成一个“包装”的构造,因为之前的腹部手术,包括fundoplication和胃造口术。胸膜、纵隔排水管插入,胸骨被关闭在层。气管造口管改为大小5.0 Portex Bivona(史密斯医疗、阿什福德、英国、gydF4y2Bahttps://www.smiths-medical.comgydF4y2Ba)。术后抗生素,包括阿米卡星和teicoplanin。gydF4y2Ba

RgydF4y2Ba试验结果gydF4y2Ba

立即术后支气管镜检查显示贪污是专利和吻合完好无损。后trachealis墙似乎部分脱垂进入气道,但这是提高了正压通气(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA)。可以通过一个灵活的支气管镜(大小4.0毫米;东京新宿奥林巴斯公司,,gydF4y2Bahttps://www.olympus-global.comgydF4y2Ba通过嫁接到船底座)。立即重新呼吸机支持通过气管造口术提供但以最小的压力设置。气管造口术是在24小时内规模uncuffed开孔管。gydF4y2Ba

病人容忍浓的食物没有愿望的迹象,在24小时内用完整的句子。她继续取得良好的进展,减少呼吸机支持和无创正压通气。Microlaryngoscopy和支气管镜检查用于移植监测和删除多余的分泌物和粘液栓。通过专利气管支气管造影显示动态信息只有轻微的软化,所以气管造口术是uncuffed 5.5 Bivona管更大。最小压力需要积极的支持而言不啻结束呼气压力设定的10/5gydF4y2Ba_2gydF4y2Bao .调湿氧与普通喷雾器在提供与普通胸部物理治疗。最初,病人动员和行走距离大于100米没有问题,之前不可能距离。监测气道持续内窥镜直接评价和支气管造影(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB和gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)。gydF4y2Ba

13天重症监护的支持后,病人被转移到当地医疗中心,执行类似的监控。她在间歇正压通气支持,容忍1小时一次设备。评估气道持续根据临床需要,同时有一个轻微的观察程度的软化,不干预是必要的。然而在15天,病人发达的通气妥协。在支气管镜的评估中,有进展的气管移植物缩小。临床医生怀疑可能发生了急性外在压缩事件(胸廓内的出血是猜测)。长时间的呼吸停止了,大脑缺氧损伤和水肿。女孩的条件在24小时内被认为是不可逆转的,她死后撤回的呼吸机支持父母的同意。gydF4y2Ba

DgydF4y2BaiscussiongydF4y2Ba

气管更换被提议作为解决终末期患者上呼吸道疾病的常规治疗策略目前失败(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。上呼吸道疾病的复杂性意味着没有单一、明确的战略替代。大量潜在的气管支架和外科植入和/或重建的技术已经被描述gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。这些解决方案包括合成材料(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),同种异体气管(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),主动脉移植(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)和复合自体组织重建。气管病理学的异构表示已经添加到图像的复杂性,和因此奇怪个人组织开发了自己的方法来治疗严重气道妥协。gydF4y2Ba

组织工程移植已应用于临床,取代泌尿生殖组织,包括部分膀胱替代,阴道和尿道gydF4y2Ba12日23gydF4y2Ba]。其他组织工程解决方案包括表皮(gydF4y2Ba24日,25gydF4y2Ba),角膜(gydF4y2Ba26日,27日gydF4y2Ba],血管[gydF4y2Ba28、29gydF4y2Ba),气管移植(gydF4y2Ba14、15gydF4y2Ba]。常见很多已经使用支架的仿生本机正常组织和细胞的播种居民在目标站点。为了避免拒绝,一般自体种子细胞,也就是说,来自病人活检。体外细胞往往扩大,直到实现所需的数量和检查的可行性,没有感染,保留所需的表型。细胞随后播种到支架体外生物反应器和构造用作移植移植物/器官[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。Recellularization似乎特别气管移植的关键,移植没有细胞均匀未能适当改造(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。种子细胞的确切作用,尤其是msc等多功能细胞,是未知的,但假设包括参与修复重新繁衍的移植(例如,分化成软骨细胞),修改再生过程改变了宿主的免疫反应(例如,促进pro-repair M2巨噬细胞反应)(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,加速血管生成。有针对性的研究在这些地区应是优先考虑的事情。gydF4y2Ba

组织工程移植物被选为这个富有同情心使用应用程序由于观察到类似的成功移植在紧急条件下用于成人(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba和一个小男孩gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),两人取得长期生存。尽管术后干预需要在这两种情况下的膨胀和扩张,这是没有什么不同的安置需要在常规气管手术。患者都有专利航空公司已经能够重返工作和学校,分别。方法应用旨在取代气道,“同比”移植解剖学上和功能上类似于本机气管和不需要免疫抑制,这两者都是直观的优点。gydF4y2Ba

与气管移植,越来越强调的重要性,一个可行的上皮细胞层改善修复和再生gydF4y2Ba33、34gydF4y2Ba]。在这种情况下,我们能够提供上皮细胞组织工程移植物GMP合规性。然而,自体的细胞代表一个重大的挑战由于困难在扩大足够数量的细胞小样本/活检。随后的临床病例,我们已经开发出一种协议人类呼吸道上皮细胞的快速扩张,保留基底细胞标记表达式和分化能力,可能克服这个障碍gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在我们之前有同情心的气管更换情况下在天啊gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),我们使用了一个内部生物可降解支架(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。这个保险提供生物力学完整性的减少,但我们观察到一个强烈的腔内的炎症反应,导致重大的发病率在术后早期。这是至少部分由于支架材料,通过随后的经验所示支架(儿童gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。贪污早些时候也,这不是播种选择和上皮细胞,而不是依赖于扩大切除粘膜活检获得支架腔内表面上。由于延迟愈合,最终上皮覆盖被认为是来源于灶接受者上皮细胞而不是从活组织检查(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。我们在这里描述,时间要求允许自体细胞扩张和播种在生物反应器。我们选择了一个non-stented支架移植物为了保持这些细胞尽可能和避免与可吸收支架相关的发病率。gydF4y2Ba

它是合理的假设,组织工程的生物力学刚度植入年初几周和几个月可能会减少发生重构和血管再生,而且这个过程导致了严重的阻塞性事件在目前的情况下。我们无法证实这一点,因为后期检索的腐败是不可能的(减少了病人的亲属的要求)。出于同样的原因,我们无法确认是否急性梗阻的机制是一个贪污的主要故障,严重软化,或继发于extraluminal压缩。尽管如此,气管移植的临床事件让我们推荐支架至少移植后的头几个月。更多的证据的生物工程气管周围的生物力学性能的变化相关的体内模型或从人体试验的经验是必需的。如果改变长期生物力学完整性,外部支架也可能代表一个潜在的解决方案。值得注意的是以前的猪研究没有观察到这种机械的变化当移植(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba),这可能代表物种固有的差异和/或体内模型不能复制病理复杂气道患者。gydF4y2Ba

据我们所知,这是第一次在组织工程气管准备完整的临床标准(GMP,英国)。构成细胞和支架,以及最终的复合播种贪污,准备根据验证标准操作程序和质量控制和发布标准(上层阈值最大的DNA检测HLA类的内容去细胞后并没有我表情脱细胞支架;不育的脚手架,msc,上皮细胞;没有可检测内毒素)。由于这种情况下,我们已经能够确定改进领域,在各领域的制备和质量控制,这直接导致了协议,现在MHRA和可以告知未来临床试验批准的气管和喉组织工程移植物。这些希望翻译的经验教训是无价的组织工程产品的一系列未满足临床需求。gydF4y2Ba

有争论最科学有效的和道德的方式引入新颖的外科手术技术,包括那些涉及ATMP,这里(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。许多国家规范的使用新颖的治疗有同情心的目的。在英国,hospitals need specific licensing, as do the laboratories preparing the therapeutic product (a specials license). There is some variation between hospitals regarding local ethical review, but, in general, a properly constituted clinical ethics committee needs to consider the individual case and a dedicated, preferably independently monitored, consenting process developed. It is also important that patients are not approached as research subjects and that no procedures, such as biopsies and imaging, are performed that are not strictly required for clinical purposes without full discussion with and approval from the patient, their family, and appropriate ethics and regulatory bodies.

我们相信成功和富有同情心的失败都使用的报道“first-in-human”情况下必须结合临床前数据构建应用程序为临床试验监管机构授权(授权临床试验,英国;FDA的试验性新药应用程序在美国)。相反,失败报告干预下进行同情使用立法,尤其是当结果并不有利,可能不公平地斜文学和导致不适当的安全性和潜在的有效性的结论。漏报的负面或null的结果是一个重大威胁,很少有激励措施,以防止这种类型的发表偏倚(gydF4y2Ba40、41gydF4y2Ba]。我们提倡一种标准化的方法来形成一个国际注册文档应用程序的ATMPs慈悲的使用登记、分析和发布的结果给予批准的先决条件。gydF4y2Ba

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基于我们之前的成功经验,我们开发了一种组织工程气管代替关键气管狭窄的女孩不适合传统的重建技术。贪污准备完整的GMP标准。早期的结果是令人鼓舞的,证明了立即改善运动耐量。然而,急性事件,推测急性软化和/或胸内的出血,引起气道阻塞3周,导致了她的死亡。这段经历已经允许我们显著改善GMP和临床协议来减少风险和提高未来患者的治疗结果。具体来说,我们提倡使用留置支架植入后几个月。我们的GMP和临床协议将塑造未来的I / II期临床试验替代气管。我们提倡的形成一个国际注册的临床ATMPs交付富有同情心的用例。gydF4y2Ba

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C.R.B.由威康信托基金会支持临床研究培训奖学金。由MRC N.J.H.支持临床研究培训奖学金。S.M.J.是威康信托基金会高级研究员在临床科学(WT091730AIA)。P.D.C. NIHR支持。石油醚和M.A.B. MRC项目支持格兰特(G1001539, ID 97817)。gydF4y2Ba

一个gydF4y2BauthorgydF4y2BaCgydF4y2BaontributionsgydF4y2Ba

M.J.E.:manuscript writing, clinical care; C.R.B.: manuscript writing, clinical care; M.A.B.: manuscript writing, clinical care; M.W.L. led the GMP production of the product, critical review of manuscript; A.V.-J.: GMP manufacture of the product; L.P.: GMP manufacture of the product; E.S.: GMP manufacture of the product; C. Carvalho: GMP manufacture of the product; C. Crowley: GMP manufacture of the product; T.A.: developed and assisted with decellularization protocols; P.L.: developed and assisted with decellularization protocols; P.S. developed and assisted with decellularization protocols; S.M.J.: led epithelial programme, critical review of manuscript; R.E.H.: manuscript writing; P.D.C.: critical review of manuscript, clinical care; N.J.H.: clinical care; A.F.: clinical care; C.M.: clinical care; D.R.: clinical care; N.M.: clinical care; R.H.: clinical care; D.C.: clinical care.

DgydF4y2Baisclosure的gydF4y2BaPgydF4y2Ba这种不gydF4y2BaCgydF4y2Baonflicts的gydF4y2Ba我gydF4y2Ba兴趣的gydF4y2Ba

M.A.B.从联合资助研究经费Videregen和ReNeuron。作者指出任何潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

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作者指出gydF4y2Ba