金黄色葡萄球菌的有效控制肺部感染,尽管三级淋巴结构杂乱无章
- 露塞尔认为1,2,
- 克马丁1,2,
- jean - luc Teillaud3,4,
- 海琳Lafoeste1,2,
- Hugues Vicaire1,2,
- 摩诃Zohra Ladjemi1,
- 艾米莉Ollame-Omvane5,
- 苏菲Siberil5,6和
- Pierre-Regis Burgel1,2,6⇑
- 1科钦,巴黎大学,研究所INSERM U1016,巴黎,法国
- 2医院服务de Pneumologie科钦,AP-HP,巴黎,法国
- 3实验室“免疫微环境和免疫疗法”,中心d 'Immunologie et des疾病Infectieuses(会),巴黎,法国
- 4将进医学院学习INSERM umr 1135年,巴黎索邦大学,巴黎,法国
- 5de矫揉造作的des Cordeliers中心,由巴黎索邦大学、巴黎大学,巴黎,法国
- 6这些作者的贡献同样这项工作
- 27岁的Pierre-Regis Burgel街郊区圣雅克,75014年的巴黎,法国。电子邮件:pierre-regis.burgel在{}aphp.fr
文摘
背景三级淋巴结构(TLS)是由持续的支气管肺的感染金黄色葡萄球菌,但他们的角色仍然是难以捉摸的。本研究试图检查B -的影响和/或t细胞耗竭金黄色葡萄球菌感染和TLS开发(淋巴新生)在老鼠身上。
方法C57Bl / 6小鼠预处理与1)anti-CD20单克隆抗体(mAb) (B细胞耗竭)或2)anti-CD4和/或anti-CD8马伯(t细胞耗竭)或3)anti-CD20、anti-CD4和anti-CD8马伯(B -和t细胞耗竭)或4)同形像马伯的控制。淋巴细胞耗竭后,小鼠感染气管内的琼脂糖珠包含的滴注法金黄色葡萄球菌(106CFU /鼠标)。14天后,细菌负荷和肺部炎症细胞浸润被文化和免疫组织化学评估,分别。
结果14天之后金黄色葡萄球菌珠滴剂,肺部细菌负荷控制和lymphocyte-depleted老鼠之间的可比性。在TLS观察肺部受感染的老鼠与控制马伯预处理,这些结构混乱或废除lymphocyte-depleted小鼠的肺。CD20的缺失+对CD3细胞没有影响+t淋巴球浸润,而CD4细胞+/ CD8+CD20 t细胞耗竭显著减少+b细胞的渗透。CD4枯竭+或CD8+t细胞分别对b细胞浸润的影响有限,但导致没有生发中心。
结论TLS杂乱无章并不是与损失有关的感染控制老鼠持续感染金黄色葡萄球菌。
文摘
杂乱无章的支气管旁淋巴滤泡没有导致增加细菌负荷和减少生存持久肺部感染的小鼠模型。淋巴滤泡可能不是必要的控制肺部细菌感染。https://bit.ly/3lOgNEG
介绍
囊性纤维化患者免疫反应的航空公司(CF)或non-CF支气管扩张疾病是由先天免疫,增加气道粘液堵塞(1,2和大量的中性粒细胞浸润3- - - - - -5]。然而,研究使用CF患者肺外植体获得[6- - - - - -9)或使用支气管扩张患者的手术切除肺组织(6,10]发现肺内的适应性免疫反应的证据,以支气管旁的B - t淋巴球的聚合物。这些淋巴聚集通常是组织成三级淋巴结构(TLS)包含隔离B和t细胞区域,高内皮小静脉(戊肝病毒),滤泡树突细胞(种)和生发中心(6]。持续的呼吸道感染C57 / Bl6小鼠铜绿假单胞菌或与金黄色葡萄球菌,两个主要的细菌中发现的CF患者的呼吸道,引发支气管旁TLS的发展(这一过程称为淋巴新生)14天内(6,11]。这些数据表明,TLS CF患者或non-CF支气管扩张导致慢性细菌感染引发的免疫反应(6]。
机制导致肺淋巴新生已经部分阐明(12),但角色与细菌感染有关的TLS在慢性气道疾病仍然是难以捉摸的。TLS可能导致对细菌感染的免疫反应(13,14),限制了气道感染的程度通过通过激活b细胞抗体的产生。另外,细菌感染可以引起肺组织损伤,这可能导致自体抗原的释放,导致B和t细胞反应,使组织损伤(13,14]。因此,目前尚不清楚是否针对肺淋巴新生将有害的或有益的呼吸道疾病与慢性细菌感染有关。
在目前的研究中,我们分析了适应性免疫的组件的角色TLS在慢性肺部感染淋巴细胞的选择性阻断招聘子集用单克隆抗体(mab)小鼠模型的持久性金黄色葡萄球菌感染。因此,我们有针对性的B -和/或CD4细胞+和CD8+淋巴细胞在诱导持续金黄色葡萄球菌对细菌感染和肺部感染和探讨了影响淋巴新生。
方法
持续的呼吸道感染的小鼠模型
女性C57Bl / 6小鼠(年龄在6 - 8周)从Janvier购买(圣Berthevin、法国)。持续的呼吸道感染通过气管内的琼脂糖珠包含的滴注法金黄色葡萄球菌(106CFU /动物)如前所述6),而安乐死滴剂后14天。所有动物实验获得批准(# 4664和# 12190)伦理审查委员会的查尔斯·达尔文(巴黎索邦大学、巴黎、Fance)。
CD20的损耗+b细胞和/或CD4细胞+/ CD8+t细胞
CD20的损耗+b细胞和/或CD4细胞+/ CD8+t细胞是通过注入anti-CD20和/或anti-CD4 anti-CD8消耗马伯,分别描述图1。对于CD20+b细胞耗竭,一剂250μg鼠标IgG2a anti-mouse CD20马伯(克隆5 d2;请提供的基因泰克,旧金山,美国CA)静脉注射7天前金黄色葡萄球菌含珠滴剂(图1一个)。对CD4+和CD8+t细胞耗竭试验,小鼠腹腔注射收到250μg anti-mouse CD4马伯(鼠IgG2b,克隆GK1.5;BioXCell、西黎巴嫩,NH、美国),和250年μg anti-mouse CD8马伯(鼠IgG2b,克隆YTS169.4;BioXCell),分别为5和4天前金黄色葡萄球菌含珠滴注法。老鼠收到第二个i.p。注入250μg anti-CD4和250年μg anti-CD8马伯4和5天后气管内的滴剂,分别为(图1 b)。一群老鼠收到anti-CD20马伯结合anti-CD4和anti-CD8马伯(B -和CD4结合+/ CD8+t细胞耗竭,图1 c)。
进一步探索CD4的各自的角色+或CD8+t细胞在TLS的发展,两组小鼠CD4耗尽+或CD8+t细胞由两个i.p。注射250μg鼠anti-mouse CD4或250μg老鼠anti-mouse CD8,分别。
对照组的老鼠收到类似剂量的isotype-matched控制马伯(鼠标IgG2a马伯,克隆C1.18.4和/或老鼠IgG2b马伯,克隆LTF-2;BioXCell)。CD20的损耗+b细胞和/或CD4细胞+/ CD8+t细胞的流式细胞术分析证实了动物的血,1天金黄色葡萄球菌珠滴注法。只有动物表现出血液的b细胞和/或CD4和CD8 t细胞的百分比小于5%与马伯预处理后随后被感染金黄色葡萄球菌包含珠子。
肺部细菌负荷
小鼠安乐死后14天金黄色葡萄球菌含珠滴注法和肺匀浆总量的10倍稀释镀trypticase大豆琼脂。CFU计数进行24小时孵化后37°C。
免疫组织化学染色
肺被移除后冲洗4%多聚甲醛通过正确的吹进的心,用4%多聚甲醛−20而言不啻5分钟2o . 5-μm石蜡的小鼠肺应用如前所述[6)检测淋巴细胞(CD20+)、淋巴细胞(CD3+),戊肝病毒(外围节点adressin (PNAd+))、种(CD21。表征+)和增殖细胞核抗原+;识别的生发中心)。详细描述主要来源的抗体,稀释和揭露技术提供补充表S1。生物素化的anti-mouse、anti-rabbit anti-rat抗体或抗体(稀释1:200;美国向量实验室,伯林盖姆,CA)被用于二次抗体和结合抗体呈现avidin-biotin-peroxidase复杂的方法根据标准协议(精英ABC设备;向量的实验室)。组织部分与苏木精复染色实验室(向量)。
的形态学分析
定量的形态学分析是由两个独立的观察者使用光学显微镜(徕卡微系统公司位于德国)连接到一台计算机(6]。定义为一个CD20淋巴聚集+或CD3+细胞总可以发现使用一个低功耗领域(×16)。简单地说,使用光学显微镜图像采集与徕卡应用程序套件软件(版本4.1.0;徕卡微系统)和工具在图像轮廓J软件(版本1.48,美国国立卫生研究院的贝塞斯达,医学博士,美国)用于测量组织区域。淋巴聚集的数量是每厘米表示2的肺部组织。
流式细胞术
表面着色的血液和肺细胞根据标准协议和执行分析使用LSRFortessa (BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)流式细胞分析仪和Kaluza软件(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)。流式细胞术分析肺组织,通过正确的心脏,肺和PBS刷新收获并立即在染色缓冲储存在4°C (PBS, 0.5%牛血清白蛋白和EDTA 2毫米)。肺被孵化的1 h在37°C RPMI中补充μg·200毫升−1Liberase TL, 0.1 mg·毫升−1DNAse我(罗氏诊断,曼海姆,德国)和0.5毫米EDTA。红细胞被淘汰使用氯化铵钾溶解缓冲区。血液和肺细胞和抗体染色中描述补充表S2。
统计分析
从形态学和流式细胞术分析获得的数据进行了分析使用非参数Mann-Whitney或克鲁斯卡尔-沃利斯测试。interobserver系数变化的形态学尺寸总是小于15%。所有分析使用棱镜8软件(美国GraphPad拉霍亚,CA)。假定值< 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
CD20的影响+淋巴球和/或CD4细胞+/ CD8+早期消耗上金黄色葡萄球菌肺部感染
我们首先建立协议获得CD20的损耗+b细胞和/或CD4细胞+/ CD8+t细胞保存所有的14天金黄色葡萄球菌C57Bl / 6小鼠感染。一个单一的注射。注入anti-CD20马伯诱导b细胞耗竭的肺,它持续≥21天经流式细胞术和免疫组织化学染色(补充图S1)。每9天注射anti-CD4和anti-CD8马伯重复诱导持久CD4细胞+/ CD8+t细胞耗竭在肺部(补充图S1)。注入的控制对CD20马伯没有影响+b细胞和CD4+/ CD8+细胞在肺部。
研究CD20的效果+b细胞和/或CD4细胞+/ CD8+在t细胞耗竭金黄色葡萄球菌感染C57Bl / 6小鼠注射anti-CD20之前和/或anti-CD4 / CD8马伯气管内的琼脂糖珠包含的滴注法金黄色葡萄球菌(106CFU /动物);动物实施安乐死在感染后14天(图1)。在所有的实验小组,没有老鼠死于感染的14天。anti-CD20治疗和/或anti-CD4 / CD8马伯没有显著影响肺气管内的细菌负荷在14天后滴剂(补充图S2)。
CD20的影响+淋巴球损耗和/或CD4细胞+/ CD8+早期消耗上金黄色葡萄球菌全身的支气管旁淋巴新生
如前所述,金黄色葡萄球菌感染导致支气管旁淋巴新生14天内(6),这一过程不受控制马伯预处理。滴剂后14天金黄色葡萄球菌包含珠子、支气管旁淋巴聚集bead-containing支气管周围被发现;这些聚合物含有b细胞区域(CD20+)和滤泡树突细胞(CD21。表征+)和生发中心(细胞核抗原+),t细胞总量(CD3包围+包含高内皮小静脉(PNAd)+),符合TLS。代表提出了显微照片补充图S3。
预处理与anti-CD20马伯之前金黄色葡萄球菌感染,支气管旁b细胞的缺失,CD21。表征+种(图2和3)和生发中心(补充图S4和S5)。相比之下,CD3+t细胞招聘(图2和3)和戊肝病毒形成的影响(补充图S4和S5)。
预处理anti-CD4 / CD8马伯之前金黄色葡萄球菌感染显著减少CD3的存在+t细胞,尽管小支气管旁CD3+(大概CD4−/ CD8−)t细胞聚集bead-containing周围发现航空公司(图2)。治疗anti-CD4 / CD8马伯也降低戊肝病毒形成和废除生发中心形成(补充图S4和S5)。令人惊讶的是,治疗anti-CD4 / CD8马伯减少支气管旁CD20的存在+B淋巴细胞和CD21+FDC (图2和3 b)。治疗anti-CD4 / CD8马伯显著降低数量(图4一)和大小(图4 f)金黄色葡萄球菌全身的CD20+分别淋巴聚集了大约3至6倍。进一步探索CD4的各自的角色+和CD8+t细胞在金黄色葡萄球菌全身的TLS的形成,两组老鼠预处理与anti-CD4或anti-CD8马伯之前金黄色葡萄球菌感染。预处理和anti-CD4 anti-CD8马伯没有减少CD20的数量+(图4一)或CD3+(图4 d)支气管旁淋巴聚集,种的招聘(图4 b)和戊肝病毒的数量(图4 e),但阻止生发中心形成(图4 c)。然而,注入anti-CD4马伯CD20的大小减少+支气管旁淋巴聚集(图4 f)。
最后,预处理和anti-CD20 anti-CD4 / CD8马伯之前金黄色葡萄球菌感染完全阻止淋巴新生。正如所料,支气管旁b细胞的存在以及CD21。表征+FDC招聘和生发中心形成被废除。支气管旁CD3+t细胞的招募和戊肝病毒的形成也明显下降(图2和3 c,补充图S4和S5)。
讨论
在目前的研究中,我们研究了CD20的角色+淋巴细胞和/或CD4细胞+/ CD8+t淋巴球在抗菌反应和支气管旁淋巴新生小鼠模型的持久性金黄色葡萄球菌肺部感染。我们的研究结果表明:1)淋巴新生的封锁并没有增加死亡率或增加肺部细菌负荷小鼠感染金黄色葡萄球菌14天;2)CD20+淋巴细胞CD4+和CD8+t淋巴球淋巴都需要再生和生发中心形成;和3)CD20的缺失+CD3细胞没有影响发展+t细胞支气管旁聚集,而CD4细胞+/ CD8+CD20 t细胞耗竭显著减少+b细胞聚集。这些发现提供进一步的见解对肺部陈化淋巴再生机制和可能的角色TLS的慢性呼吸道疾病。
因为淋巴滤泡窝藏TLS的特点开发成一个持久的结果在小鼠呼吸道细菌感染(6),我们假设这些TLS导致肺部感染的控制。这个假设是强化了最近发现Ladjemi等。(15期间,TLS)报告增加了IgA生产持久的铜绿假单胞菌感染小鼠,发现支气管肺泡灌洗IgA是指向铜绿假单胞菌。然而,杂乱无章的淋巴新生使用anti-CD20和/或anti-CD4 / CD8马伯并未导致减少了感染控制,当我们发现没有证据表明增加细菌负荷和没有证据表明减少生存在这些实验。我们所知,没有其他研究检验了可能的角色的TLS慢性呼吸道细菌感染的控制。先前的研究已经产生了不同的结果可能的抗感染作用的TLS在肺部(13]。米oyron -问uiroz等。(16]首先提出肺淋巴滤泡和TLS的特点导致了感染控制小鼠缺乏二级淋巴器官感染流感病毒,可能通过b细胞的成熟和选择针对流感病毒核蛋白(17]。对小鼠的研究缺乏IL-23或CXCR5也表明,肺组织TLS与可怜的保护性免疫反应结核分枝杆菌(18,19),表明TLS的角色结核分枝杆菌容器。Eddens等。(20.)表明,肺孢子菌肺部感染诱导TLS包含生发中心;研究淋巴毒素(LT)α-deficient老鼠导致较小的,较低的一塌糊涂,淋巴滤泡生发中心,缺乏增殖b细胞的数量。然而,LTα-deficient老鼠能够清楚肺孢子菌在第14天感染后像野生型小鼠C57Bl / 620.),这表明TLS没有要求肺孢子菌间隙。我们建议陈化TLS可能导致免疫反应(例如,通过IgA生产(15]),但不是必不可少的控制慢性细菌感染小鼠肺。
我们的研究进一步提供了见解的角色B和t细胞亚群在肺的陈化TLS的形成。首先,我们的数据显示,b细胞、CD4细胞+和CD8 t细胞+t细胞都需要生发中心的形成,这是TLS的标志抗原的适应性免疫应答的启动(21,22]。第二,anti-CD20马伯耗尽在TLS b细胞而不影响t细胞聚集,而联合治疗与anti-CD4 / anti-CD8马伯降低t细胞和b细胞的数量聚集。老鼠专门在CD4耗尽+t细胞有比较多的b细胞聚集,不过小。这些数据有些不同,发现由Eddens等。(20.)报道,CD4的损耗+t细胞与anti-CD4马伯废除b细胞毛囊的组织和损害的积累和扩散激活b细胞。在目前的金黄色葡萄球菌模型中,杂乱无章的b细胞毛囊所需CD4的损耗+和CD8+只有CD4 t细胞,而孤立的枯竭+或CD8+t细胞并没有减少CD20的数量+支气管旁淋巴聚集,这表明CD4细胞+和CD8+t细胞与b细胞的招募和/或扩散模型。这些数据还表明,CD8+t细胞是没有参与招聘的b细胞,成熟但很重要的TLS的生发中心的外观。我们的数据在CD8+t细胞耗竭并行C的报告urtiset al。(23)表明,CD8的损耗+t细胞不降低免疫细胞的招募。然而,在后者中,CD8的影响+t细胞耗竭在TLS没有记录。我们进一步推测,减少支气管旁淋巴聚集的大小金黄色葡萄球菌来华的动物预处理anti-CD4马伯CD4的减少有关+T卵泡辅助细胞,它描述了支持b细胞抗原的选择、生存和增殖24]。
目前研究的优点和局限性。我们的动物模型是来自C的重要模型灰等。(25),细菌被嵌入在琼脂糖珠。该模型模拟长时间在CF呼吸道感染细菌通常禁锢在粘液栓在气道腔(26,27]。在这个模型中,支气管旁淋巴新生仅限于局部地区存在感染的琼脂糖珠(6]。尽管琼脂糖珠模型开发,目的是逃避宿主的免疫环境在肺25,28B),ragonzi等。(29日)表明,细菌被发现为macrocolonies气道腔内部和外部的珠子,观察也发现在我们的研究(露西尔和瑞吉斯Burgel,科钦研究所和大学巴黎,巴黎,法国;未公开的数据)。重要的是,研究表明,琼脂糖bead-embedded小鼠气管内细菌繁殖,细菌负荷可以减少抗菌药物治疗30.,31日]。在实验中淋巴细胞耗竭的影响,旨在评估治疗小鼠anti-CD20抗体有效有针对性的CD20+b细胞,在治疗动物的血液和肺察觉≥21天。协议用于目标t细胞是更复杂的建立,因为他们需要重复插入anti-CD4和anti-CD8马伯,没有消除CD3+/ CD4−/ CD8−淋巴细胞)。然而,这些协议能检查个人和CD4结合的贡献+和CD8+t细胞淋巴新生。
淋巴滤泡生发中心包含在多个慢性呼吸道疾病,包括严重的哮喘,严重的慢性阻塞性肺病,和CF non-CF支气管扩张,但他们的角色仍不完全清楚。TLS的COPD患者的肺内一直与疾病进展(32)和肺b细胞,由基因表达分析显示一致的相关性与肺气肿严重程度(33]。研究报道的主要角色b细胞活化因素发展的TLS和肺泡破坏小鼠暴露于香烟烟雾(34),结果高度相关的COPD患者(32]。此外,μMT老鼠,缺乏b细胞,淋巴滤泡和肺气肿后暴露于香烟烟雾中(35]。在后者的研究中,作者还发现b细胞巨噬细胞积累的有力监管机构和macrophage-derived矩阵metalloproteinase-12生产,导致肺气肿的发展。因此,发展的TLS肺气肿的作用是建立在动物模型。我们的实验是为了检查TLS在感染控制的作用,但更多的研究是必要的检查的可能贡献TLS气道重构的背景下持续的细菌感染。一个未经证实的,然而,可测试的假设是,TLS可能导致支气管扩张的发展。
总之,我们的研究表明,开发期间持续的呼吸道感染的支气管旁TLS agarose-bead嵌入细菌不是必不可少的控制引发的持久肺部细菌感染。它进一步表明,淋巴CD20的再生是一个高度协调的事件+淋巴细胞和CD4+和CD8+t淋巴球所需的生发中心形成抗原可以发起的适应性免疫反应通过特定的b细胞的选择和扩散。未来的研究应该把精力集中在TLS的寿命在航空公司和其可能的角色在促进气道重构的慢性细菌感染。
补充材料
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确认
我们感谢Genentech(美国旧金山,CA)提供的anti-CD20抗体用于b细胞耗竭。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
利益冲突:l .方面没有披露。
利益冲突:c·马丁报告的个人费用从Zambon外提交的工作。
利益冲突:J-L。Teillaud没有披露。
利益冲突:h . Lafoeste没有披露。
利益冲突:h . Vicaire没有披露。
利益冲突:M.Z. Ladjemi没有披露。
利益冲突:大肠Ollame-Omvane没有披露。
利益冲突:美国Siberil没有披露。
利益冲突:P-R。从阿斯利康Burgel报告个人费用,勃林格殷格翰的发言,奇诺华,辉瑞,顶点,Zambon Insmed,外提交的工作。
支持声明:这项工作是由Vaincre la Mucoviscidose和杜拉基金会杂音/昏聩de矫揉造作的en桑特Respiratoire腿帕斯卡阀盖。资金来源没有参与研究设计;的收集、分析和解释数据;报告的编写和提交的决定发表的文章。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2020年3月19日。
- 接受2020年10月11日。
- 版权©2021人队