不同的gut-lung轴和失调降低通风早产儿的航空公司
- 1儿童健康的部门,医学院卡迪夫大学、卡迪夫、英国
- 2伦敦大学学院儿童健康研究所,伦敦,英国
- 3新生儿加护病房,北布里斯托尔NHS信托,英国布里斯托尔
- 4卡迪夫大学生物科学学院、卡迪夫、英国
- 5部门综合系统的医学和消化疾病,伦敦帝国理工学院,英国伦敦
- 6共同第一作者
- Sailesh Kotecha、儿童健康部门的医学院,卡迪夫大学,希斯公园,英国卡迪夫CF14 4 xn,。电子邮件:kotechaS在{}cardiff.ac.uk
文摘
背景早产儿慢性肺疾病(CLD),也称为支气管肺的发育异常,是一个早产的主要后果,但微生物在其发展的作用仍不清楚。因此,我们评估通风早产儿的细菌群落的发展随着时间的推移,上、下呼吸道,和评估gut-lung轴通过比较在凳子上的上、下呼吸道细菌社区发现。最后,我们评估是否细菌社区与肺部炎症建议失调有关。
方法我们连续采样多个解剖站点包括上呼吸道(鼻咽吸入等),降低航空公司(气管吸入流体和支气管肺泡灌洗液)和通风preterm-born婴儿的肠道(粪便)。细菌DNA负荷测量在所有样本和使用16 s rRNA的V3-V4区域测序基因。
结果276年从1102年(539年鼻咽吸入物、气管吸入液体,89年支气管肺泡灌洗,198份粪便)样本55早产儿,352(32%)适当放大16 s RNA基因测序。细菌负荷很低在出生时并迅速随时间增加,但与主要业务分类单元(辣子鸡)所有样本类型。细菌有不同社区之间的上、下呼吸道和肠道,与一个单独的dysbiotic炎症过程发生在婴儿的低的航空公司。个人辣子鸡是与炎症标记物增加有关。
结论总的来说,这些发现表明,靶向治疗的主要生物,包括那些没有常规治疗,等Ureaplasmaspp,可能会降低CLD preterm-born婴儿的发展。
文摘
出生后呼吸殖民收购和相关的炎性反应,表明感染过程中婴儿早产的患慢性肺病的风险(CLD),从而减少CLD的目标http://bit.ly/31C27iX
介绍
早产儿慢性肺疾病(CLD),也称为支气管肺的发育异常、早产的一个主要后果是受到许多早期生活因素的影响,包括交付肺发展处于初级阶段,需要呼吸支持和补充氧疗法(1]。我们以前显示的主要细菌与CLD的发展有关,可能通过肺部炎症通路(2,3]。此外,特定的生物等Ureaplasma强烈的发病机制涉及CLD [4,5),有一些证据表明根除Ureaplasma可能会降低利率CLD的6]。term-born婴儿,早期的上呼吸道细菌殖民化似乎发生在几分钟内出生的7)或产前,但殖民的自然历史早产儿肺的上部和下部航空公司是不太清楚8]。最近的一项系统回顾(9]调查早产儿呼吸道微生物的发展提出更多的细菌殖民化问题比回答与现有研究早产儿肺;没有研究调查了上呼吸道和消化道之间的联系,即。拟议中的gut-lung轴,降低早产儿的航空公司。六项研究包括(10- - - - - -15显示变量的结果,如。报告进展变形菌门和厚壁菌门,但另一个显示反向发展。提供一个更全面的评估细菌社区在早产儿的风险开发CLD,我们研究1)连续多个解剖网站,包括获得气管吸入液体(TAF)和支气管肺泡灌洗(BAL)流体从通风早产儿评估气管和更低的航空公司,分别;鼻咽吸入物(NPA)和粪便样本评估通风早产儿的细菌群落的发展随着时间的推移,上、下呼吸道;2)评估了微生物粪便和上/下航空公司之间的关系,即。gut-lung轴,没有研究到目前为止在词或preterm-born婴儿;3)评估细菌社区之间的关系和临床因素,包括分娩方式,性,临床的采样和抗生素的效果;4)测量促炎细胞因子白介素(IL) 6和8的所有样本类型和相关细菌的发现社区。
方法
样品收集
早产儿的≤怀孕32周是从两个三级区域招募英国新生儿重症监护病房。TAF和NPA收集时常规气管导管(ETT)吸。BAL样品按照我们先前的研究[2,16),根据《欧洲呼吸学会工作组指南(188bet官网地址17常规ETT吸的时候,所描述的补充材料。TAF落下帷幕,NPA样本收集每日在第一周两次每周或直到拔管,无论之前发生。每周收集粪便样本,直到28天的生活。伦理批准(ref 14 / WA / 0190)获得了威尔士研究伦理委员会的2和书面知情同意是来自父母。
DNA提取、细菌负荷和测序
DNA提取、加载和16 s测序的细菌更详细地描述补充材料。总细菌负荷量化使用定量PCR分析基于出版协议(18)放大V3-V4地区16 s rRNA的基因。纯化PCR产品量化和样本足够的放大池创建一个扩增子库。单独的库准备TAF落下帷幕,NPA和粪便样本。每个库测序的Illumina公司MiSeq(美国圣地亚哥,CA)设备(19]。
数据分析
Mothur v1.39.5 [20.)是用于处理测序数据,扣除嵌合序列和低质量和组织DNA序列数据读入操作分类单位3%(辣子鸡)不同。样品与< 1000读取被排除在外。从核糖体数据库项目(参考数据库21)是用于系统发生的每个OTU王国属的识别水平。样本稀薄1000读/样品前进一步分析。统计分析了在R v3.4.2 (www.r-project.org)使用Phyloseq v1.20.0 [22]和纯素食(https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)。邮票v2.13 [23细菌谱)是用来比较不同组之间。数据集被合并在属水平比较微生物从不同的解剖网站配置文件。样品用单一OTU代表> 50%读被认为包含一个主要的生物。
结果
1102个样本收集来自55个早产儿出生在≤32周的妊娠(平均26.0周,四分位范围24.7 - -27.5周)前28天包括539 NPA岁276 TAF 89落下帷幕,198份粪便样本。所示的人口分布表1之间的数据,包括比较两个招聘中心(威尔士大学医院和北布里斯托尔的信任(电视台))。略显不成熟的婴儿被招募在电视台,虽然差异无统计学意义(26.8与25.9周,p = 0.07)。更多的动脉导管未闭被确定在电视台,因为他们为这个条件屏幕。如预期招聘只有通风早产儿,大多数婴儿发达CLD定义使用国家儿童健康和人类发展研究所的定义(24),84%的中度至重度CLD发展。
352人(32%)的1102个样本成功地为16 s rRNA基因测序与最大的成功率凳子(73%)样品和至少TAF(17%)样品(图1)。细菌负荷很低在1 - 3天,只有1.1%和6.7%的TAF和NPA样本,分别成功测序的细菌16 s rRNA基因。我们获得了粪便样本的成功率为35.7%,表明低出生时细菌负荷,特别是在上呼吸道。尽管19.4%的BAL样本用于DNA测序,细菌DNA测序一个较低的阈值被用于这些样本(DNA的浓度post-PCR放大0.3 ng·µL−1TAF和NPA 0.1 ng·µL−1对BAL和0.5 ng·µL−1凳子上)。细菌负荷高峰在4 - 7天落下帷幕,TAF样品和天8 - 14 NPA和粪便样本。有趣的是,一个类似的模式增加TAF和BAL样本的观察粪便和NPA样本(图1)。
低质量的读取和嵌合序列被移除后,意味着(范围)读取109 457 696 (8665 - 426)TAF样本;44 548(875 - 177)27日BAL样本;60 295 539 (5951 - 222)NPA样本;757和59 329(1 - 481)粪便样本,与0 2 0和39个样本,分别读取的< 1000 /样品。负的最大读取控制7558年,588年,580年和206年,分别与一个TAF样本丢弃由于co-clustering负控制样本。
大多数的门在所有样本,如图所示图2和总结补充图S1变形菌门和厚壁菌门;Tenericutes也在场,特别是TAF和BAL样本,并在较小程度上NPA样本;拟杆菌被发现在粪便样本,在NPA较小,TAF和BAL样本。门TAF和BAL的模式样本在第一个月的生活保持静态,平均相对丰富∼变形菌门的40 - 50%,而NPA变形菌门和粪便样本的增加意味着相对丰富的NPA的15%和30%在凳子上生命第一周为46%和55%,分别由第三/第四星期生活(图2;总结数据所示补充图S2)。大多数样本包含一个占主导地位的门(> 50%的阅读从一个门)。在属水平,葡萄球菌,见图3属,占主导地位的(> 50%的读取从一个属)近30%的样本,克雷伯氏菌,埃希氏杆菌属非机密的肠杆菌科,肠球菌和沙雷氏菌属主在35%,TenericutesUreaplasma和支原体所有样本的5.2%。随着年龄增长而增加变形菌门和厚壁菌门下降,特别是在NPA(变形菌门p < 0.001,厚壁菌门p = 0.008;克鲁斯卡尔-沃利斯检验与Benjamini-Hochberg错误发现率)和粪便样本,没有明显的变化模式在属水平,尽管上述属明显的主导地位。属和OTU水平,主要属/ OTU在场大多数样本,与31的34 BAL样本(91%),43的47 TAF样本(92%),122 (97%)126 NPA样本和130的145份粪便样本(90%)> 50%的读取单个主导OTU,如图所示图3。
有趣的是,每个婴儿都有他们自己的个人细菌殖民化模式之间的不同个体之间的婴儿和解剖网站(图4一和c)。由于没有整体模式随着时间的推移,我们整理样品从每个解剖部位进行进一步的分析。观察到的数量属Chao1指数样本类型之间是不同的,更大的球和TAF样本对指数(p < 0.001) (图4 b),而不是香农的或者辛普森α-diversity指标(数据未显示)时计算在属的水平上。然而,没有差异指出观察辣子鸡或Chao1 OTU级别(计算时图4 b)。这些数据的相似指数属OTU水平落下帷幕,TAF样本表明个人这些样本中大部分是辣子鸡,但属之间的指数增长和辣子鸡NPA和粪便样本显示在这些样本更丰富。β-diversity分析TAF和NPA样本没有任何明显的模式随着时间的推移,(补充图S4)。
当细菌社区被PERMANOVA检查四个样本类型之间,互相都明显不同,见图4 c:落下帷幕与TAF;落下帷幕与NPA;落下帷幕与凳子;TAF与NPA;TAF与凳子;和NPA与凳子(p < 0.01)。
发送模式影响早期殖民在许多解剖网站在新生儿和早产儿的有限的数据在粪便样本7,25,26]。生产方式的差异与增加革兰氏阴性属(不动杆菌(p = 0.04)和略假单胞菌(p = 0.06));支原体TAF样本(p = 0.04);和沙雷氏菌属在NPA (p = 0.01)从产道出生的婴儿。通过剖腹产出生婴儿,葡萄球菌增加在NPA (p = 0.02),在TAF和少量样品(p = 0.056) (补充图S2a)。然而,性没有影响TAF或NPA细菌社区(补充图开通)。细菌群落结构的一个显著差异是指出之间的招聘中心(p < 0.05) (补充图S2c)。这可能部分解释的爆发不动杆菌在一个站点,导致更大的不动杆菌观察到在招聘中心。
在招聘中心最初的预防性抗生素青霉素、庆大霉素养生法是根据后续改变微生物评估。219 276 TAF(79%)和335(62%)的539个NPA采集标本,而婴儿接受抗生素治疗(补充图S3)。样本不是抗生素时更可能成功地为16 s rRNA基因测序比样本在抗生素(或2.91,95%可信区间1.48 - -5.73;TAF p = 0.002;2.05和3.10,-4.67;NPA样品p < 0.0001)。抗生素并不影响α-diversity成功测序TAF和NPA样本,这表明他们在全球范围内抑制细菌生长,而不是抑制特定的物种。然而,抗生素与Tenericutes比例的增加有关(p = 0.03),可能由于支原体,略微增加TAF (p = 0.059)相比没有抗生素组样品。
自一个OTU成为主流阅读(> 50%)在大多数成功测序样品,与更大的初始生物量潜在的这些样品,我们测量了il - 6和引发所有样本评估成功的细菌DNA检测样品是否与炎症反应有关。il - 6和引发主要是检测不到NPA和粪便液提取,但指出大量的矿山和TAF样本如果他们可以排序,如图所示图5一个TAF和BAL样本:TAF成功测序与不成功的测序样品:il - 6 1222 (534 - 3224) pg·毫升−1与539年(217 - 1377)pg·毫升−1;,引发26 383 51 (3460 - 740)pg·毫升−1与9031年(2535 - 511)pg·毫升−1;落下帷幕il - 6 3629(2029 - 8538)和pg·毫升−1与1213年(485 - 2459)pg·毫升−1;和引发80 689 (12 303 - 196 477)pg·毫升−1与9520 (3060 - 572)pg·毫升−1(所有p < 0.001)。接下来,我们跟踪个人婴儿的动态变化,如图所示图5 b。每个婴儿情景增加il - 6,引发与细菌负荷和增加到占主导地位的辣子鸡的存在。从20情景TAF引发山峰> 50 000 pg·毫升−119中观察到婴儿,13(65%)集与业务有关的细菌DNA的24小时内细胞因子浓度峰值。il - 6和引发显示峰值浓度在7天的年龄我们先前已经表明婴儿发展中CLD [2,3,16)(图5 c)。最后,辣子鸡等的优势不动杆菌、非机密的肠杆菌科和柔膜细菌包括支原体和Ureaplasma与il - 6最大的增加密切相关,引发落下帷幕,在多方面的大于样品不能测序(图5 d)。
讨论
在这个全面的纵向研究中,我们研究了上、下呼吸道的早产儿的风险发展CLD,相关研究结果串行粪便样本评估gut-lung轴。我们取得了一些重要的观察:第一,低细菌DNA负载在生命的最初几天,增加生活的第一个月。第二,所有抽样解剖网站包括上、下呼吸道有自己的不同的细菌社区模式,在大多数情况下与主导OTU的存在,和解剖网站之间的不同。第三,细菌社区在降低航空公司与一个活跃的促炎的阶段。第四,特定的辣子鸡与显著增加促炎细胞因子有关。
总体而言,从1102年样本,31.9% (n = 352)令人满意地放大了细菌进行测序。细菌负荷很低在所有样本在生命的前3天,但达到天4 - 7的生活落下帷幕,TAF样本,在凳子上的天8 - 14和NPA样本。细菌收购是最有可能从妈妈阴道分娩相关的微生物包括Tenericutes主在阴道分娩婴儿,和葡萄球菌主交付通过剖腹产的时候。
门水平,NPA和粪便样本同样变化随着时间的增加变形菌门,保持相对静止的球/ TAF样本。Tenericutes,Ureaplasma和支原体主要是局限于下呼吸道样本只有一些在NPA样本,但几乎缺席粪便样本。相比之下,不动杆菌存在于粪便NPA样品,而不是降低呼吸道样本,反映单位的爆发。几乎所有样品主要OTU, > 90%的样品的主要OTU > 50%的读取葡萄球菌,支原体和Ureaplasma主尤其是在更低的航空公司。有趣的是,所有婴儿有自己的细菌样本类型之间的模式几乎没有重叠,建议积极感染性情景的过程。显著差异存在的社区结构的样品从每个解剖网站被PERMANOVA显示分析。α-diversity指数估计丰富显示更多的属在落下帷幕,TAF NPA或粪便样本,但差异消失在OTU水平表明更大的丰富OTU水平NPA和粪便样本。自平衡的措施(香农多样性指数)没有显示样本网站的区别,优势度的数据表明,单一OTU之间没有不同解剖网站。NPA和矿山/ TAF样本之间的差异可能部分解释的存在一个uncuffed气管内管这部分分离上部和更低的航空公司。获得更低的航空公司样本nonventilated早产或新生儿是不可能的,因此,有限的数据存在的微生物进化降低航空公司(27]。
正如前面观察term-born婴儿,生产方式的差异与比例的增加有关葡萄球菌NPA (p = 0.022)和略微TAF (p = 0.056)和增加通过剖腹产手术生的人支原体(p = 0.039)不动杆菌在TAF (p = 0.042)和样品沙雷氏菌属(p = 0.008),Ureaplasma(p = 0.024)棒状杆菌属NPA样本中(p = 0.028),阴道分娩的婴儿。性并不影响细菌群落,但中心获得的样本所影响的结果。这些结果可能部分解释的爆发不动杆菌在一个单位,但这两个中心之间的差异仍在敏感性分析婴儿殖民不动杆菌被移除,从而表明当地环境或当地人员似乎影响殖民除了母亲的环境。抗生素,正如所料,减少细菌负荷,用更少的样品适合细菌基因测序。然而,辣子鸡的多样性和数量相似的孩子出生时,打开或关闭抗生素。TAF样品中存在Tenericutes增加(p = 0.03)和一个趋势Tenericutes NPA样本增加抗生素组(p = 0.059)。
最有趣的是,我们注意到多方面的差异,il - 6和引发浓度BAL和TAF当细菌测序是可能的时候。我们的数据表明,一个感染性dysbiotic环境发生在婴儿的肺患CLD的风险。低生物量可能由于较低的细胞因子浓度稀释样品返回的样品体积的变化引起的。然而,按照我们以前的观测,il - 6和引发的整理数据显示峰值浓度的细胞因子在∼7天的年龄(2,3,16]。增加细胞因子峰值与主要辣子鸡在每个婴儿建议一个感染的过程。这是进一步支持的显著增加TAF il - 6和引发个人辣子鸡确认感染过程是常见的婴儿在肺部发展CLD的风险。
综上所述,这些数据表明,细菌群体和肺部炎症都是潜在的目标与抗菌素如阿奇霉素、抗感染和抗炎活动减少的比率CLD [6]。
这项研究有一些局限性,尤其是气管内插管的存在支持婴儿的呼吸系统。最重要的是,这排除了“健康”的收购样本早产,term-born婴儿这在伦理上是不可能的。气管内插管的存在可能物理上独立上下航空公司,但是,尽管许多婴儿长时间通风,我们注意到独立的进程在上下呼吸道和胃肠道。的强度研究是大量的样本来自多个解剖网站获得纵向,这迄今为止最大的早产儿的研究。此外,我们有相关的招聘中心之间的发现和婴儿的肺部炎症过程发生发展CLD的风险。
总之,出生时细菌负荷很低,但很快就会增加和微生物从母亲身上最有可能被收购。之间有不同上下呼吸道和肠道的细菌群落结构与一个单独的dysbiotic炎症过程发生在较低的航空公司的婴儿在发展中CLD的风险增加。此外,肺部炎症过程发生,尽管婴儿被抗生素表明微生物不容易经常使用抗生素等Ureaplasma和支原体可能占主导地位,并可能提供一个治疗的目标减少CLD preterm-born婴儿的发展(6]。
补充材料
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脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
数据共享:所有序列都已上传到EBI的ENA (https://www.ebi.ac.uk/ena)。
作者的贡献:美国Kotecha负责初步设计,加上jr Marchesi和n·克莱恩。d . Gallacher和r·瓦希负责样本集合,由美国Kotecha。d·阿尔伯·d·Gallacher和e·米切尔负责样品分析,由n·克莱因和jr Marchesi。都是负责数据收集和数据分析。手稿是所有写的。
利益冲突:d Gallacher没有披露。
利益冲突:e·米切尔没有披露。
利益冲突:d·阿尔伯没有披露。
利益冲突:r·瓦希没有披露。
利益冲突:n克莱恩没有披露。
利益冲突:jr Marchesi没有披露。
利益冲突:美国Kotecha没有披露。
支持声明:美国Kotecha收到资金从英国医学研究理事会(MRC)(先生/ M022552/1)和国家卫生研究所(NIHR) /卫生技术评估(HTA) (16/111/106)。jr Marchesi、分工的综合系统医学和消化疾病伦敦帝国学院接收来自NIHR帝国财政支持生物医学研究中心(BRC)基础医疗NHS信托帝国理工学院和伦敦帝国学院的。本文研究所资助的NIHR BRC无关,和表达的观点不一定是作者和出版的NHS, NIHR或卫生部。卡迪夫大学提供的e·米切尔博士奖学金。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2019年9月26日。
- 接受2020年2月1日。
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