嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和2型免疫微环境COPD-affected肺部组织
- Prajakta Jogdand1,
- Premkumar Siddhuraj1,
- 美智子森1,
- 卡洛琳Sanden1,2,
- 吉米·琼森2,
- 安德鲁·f·墙3,
- 詹妮弗Kearley4,
- 艾莉森·a·教训了4,
- 罗兰Kolbeck4,
- 列夫Bjermer5,
- 保罗·纽伯尔德6和
- 乔纳斯美国Erjefalt1,5⇑
- 1实验医学部门、隆德大学、瑞典隆德
- 2Medetect AB,瑞典隆德
- 3临床和实验科学、南安普顿大学、南安普顿综合医院,英国南安普顿
- 4部门的呼吸道、炎症和自身免疫,阿斯利康,盖瑟斯堡,医学博士,美国
- 5部门的呼吸医学和变态反应学、隆德大学、瑞典隆德
- 6部门的转化科学、阿斯利康、马里兰州、美国
- 乔纳斯s Erjefalt单位气道炎症,BMC D12,隆德大学,se - 221 84年,瑞典隆德。电子邮件:jonas.erjefalt在{}med.lu.se
文摘
虽然升高血或痰嗜酸性粒细胞存在在许多慢性阻塞性肺病患者,不确定性仍然lung-infiltrating嗜酸性粒细胞的解剖分布格局。嗜碱粒细胞一直在慢性阻塞性肺病几乎未被探索。本研究映射tissue-infiltrating嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和eosinophil-promoting COPD-affected肺的免疫机制。
外科肺组织活检和主要解剖室获得慢性阻塞性肺病患者的严重程度等级为慢性阻塞性肺疾病阶段I-IV全球倡议;不吸烟者和吸烟者作为控制。自动免疫组织化学和原位免疫细胞杂交鉴定,2型免疫标记GATA3和eotaxins (CCL11 CCL24)。
嗜酸性细胞和嗜碱性细胞,在所有COPD-affected肺的解剖室和非常严重的慢性阻塞性肺病的显著增加。嗜酸性粒细胞明显不足,焦eosinophil-rich微环境空间与GATA3联系在一起+细胞,包括2型辅助t细胞淋巴细胞和2型先天淋巴细胞。同样在为本地化和interleukin-33 / ST2-dependent嗜酸细胞增多症influenza-infected老鼠。两个老鼠和病人显示空间限制与CCL11 eotaxin签名+成纤维细胞和CCL24+巨噬细胞。
除了识别组织嗜碱性先进COPD的小说特征,识别空间局限eosinophil-rich 2型微环境代表了小说在慢性阻塞性肺病的免疫病理类型的异质性可能会影响个性化治疗。
文摘
高度本地化Th2——eosinophil-rich口袋中确定COPD-affected肺,人数增加与疾病严重程度增加,包括嗜碱粒细胞。这是一个小说在慢性阻塞性肺病的免疫病理类型的异质性。http://bit.ly/2HexTco
介绍
慢性阻塞性肺病影响全球发病率和死亡率(1]。潜在的疾病是慢性炎症导致支气管炎、细支气管炎和肺气肿造成长期接触吸入刺激物(如。烟草烟雾)[2,3]。慢性阻塞性肺病病理学历来是归因于先天免疫机制(3),但也激活适应性免疫机制(4,5]。免疫病理是进一步复杂化的粒细胞明显异质性概要文件,增加关注嗜酸性粒细胞签名在慢性阻塞性肺病6,7]。几项研究证明高血压和/或痰中嗜酸性粒细胞计数显著比例的COPD患者(6- - - - - -8]。聚类分析的痰粒细胞概要提出了eosinophil-rich痰嗜酸性粒细胞的迹象明显的嗜酸性粒细胞COPD表型(9]。
2型细胞因子,特别是白介素(IL) 5,嗜酸性粒细胞发展是至关重要的,成熟和组织寿命(10,11]。这个IL-5依赖的基本原理针对eosinophil-high COPD与中和anti-IL-5 (mepolizumab)和anti-IL-5 receptor-α(IL-5Rα;benralizumab)抗体(12,13]。嗜碱粒细胞也表达IL-5Rα和受IL-5 / IL-5Rα封锁[14]。然而,有限的数据存在于组织的渗透模式和密度的嗜碱粒细胞COPD-affected肺。
在COPD肺tissue-infiltrating嗜酸性粒细胞在很大程度上仍未知。先前的研究已经证实在中部和嗜酸性粒细胞存在远端隔间(15,16]。然而,重要的问题仍然是解剖本地化和渗透模式和嗜酸性粒细胞在慢性阻塞性肺病的理论基础及其免疫触发器。虽然2型经典源自antigen-activated CD4细胞因子+2型辅助t细胞(Th2)淋巴细胞、嗜酸性粒细胞可能通过激活发展2型先天淋巴细胞(ILC2) [17- - - - - -19在激活)(如。通过IL-33)可以快速瞬态2型反应(山17,18]。然而,这仍有待证明如果ILC2细胞存在于组织嗜酸性粒细胞在COPD-affected肺。嗜酸性粒细胞化学引诱物分子在慢性阻塞性肺病也需要调查。
本研究的目的是为了执行整体空间映射的tissue-infiltrating嗜酸性粒细胞COPD-affected肺部疾病在不同阶段,和识别关键免疫机制认为促进组织嗜酸性粒细胞。调查涉及重点解剖肺区域,包括差了远端肺区域。此外,我们进行了第一次系统的量化tissue-infiltrating COPD-affected肺嗜碱粒细胞。最后,使用一个实验模型,我们探讨呼吸道病毒感染的潜在嗜伊红血球过多引发的瞬态和不完整的。
材料和方法
材料和方法总结;进一步详细的程序中提供补充材料。
样本的参与者
主要研究外科组织收集来自57个病人史大学医院(瑞典Lund)和加工进行组织学分析。肺切除样本从轻微到严重慢性阻塞性肺病患者(慢性阻塞性肺疾病的全球倡议(黄金)阶段》)和控制(不吸烟者/吸烟者)划定肿瘤手术)。慢性阻塞性肺病患者非常严重(黄金IV),肺组织从移植肺移植手术后获得。病人的人口分布呈现表1。mRNA-preserved组织为原位杂交(ISH)收集从支气管活检来自30个额外的患者(补充表E2)。所有患者团体组织处理协议都是相同的。所有临床过程是经当地瑞典Lund大学的研究伦理委员会批准,瑞典。所有参与者签署知情同意表格。
免疫组织化学
抗原后检索(PT-Link;DakoCytomation、斯特鲁普、丹麦),组织部分受到自动双重和三重免疫染色(Autostainer +;DakoCytomation)。主要分析使用一个三重免疫组织化学(包含IHC)协议同时检测嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,Th2代孕GATA3标志。Th2 GATA3淋巴细胞被确定+,CD4+细胞。ILC2细胞被确定为lineage-negative CD25+,GATA3+细胞混杂non-ILC2后细胞显色前身体都被染色和变性阻塞,如前所述[20.]。此外,各种标准包含IHC细胞标记用于一般免疫细胞识别的勘探和chemokine-expressing细胞。所有抗体都广泛使用在临床诊断或研究验证(补充表E1)。
现场杂交
人类和小鼠eotaxin-1 (CCL11)和eotaxin-2 (CCL24) mRNA的视觉使用RNAscope 2.5分析工具包(美国先进细胞诊断,海沃德,CA)。部分与内源酶孵化块,煮之前与蛋白酶预处理缓冲和治疗目标探针杂交(CCL11 CCL24)。目标RNA与彩色色原放大和视觉效果。
定量包含IHC和计算机图像分析
所有全包含IHC -使用ScanScope幻灯片和ISH-stained部分数字化扫描仪(美国Aperio技术,Vista, CA)。高分辨率图像进行计算机分析,免疫反应性/检测色原颜色分割,量化和正常化分析组织区(Visiomorph;Visiopharm Hørsholm、丹麦)。每个病人的主要研究中,几个大的部分包含细支气管、细支气管(仅黄金IV),肺血管和肺泡实质进行分析,代表两到三肺区分开。X, Y坐标从computer-segmented单个细胞分析方法的空间分布和细胞集群(点模式分析)和积累GATA3细胞内定义的嗜酸性粒细胞微环境(邻居分析、细胞群体观众闭路1.22;Medetect,隆德、瑞典和蒙特卡罗模拟;补充图E1)。
模型的病毒恶化之前有和没有烟雾暴露
归档肺癌小鼠组织(21,22)被用来调查潜在的嗜酸性粒细胞趋化作用的反应和形成片状嗜酸性粒细胞在野生型或IL-33-deficient老鼠终止后6天暴露于病毒(mouse-adapted H1N1甲型流感;/ FM / 1/47-MA)有或没有11天前的日常接触烟草烟雾。这些研究是由阿斯利康的批准机构动物保健和使用委员会。
统计分析
数据分析在GraphPad棱镜(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验检测到患者组之间的整体差异,和邓恩的测试评估事后群体间的比较保守。斯皮尔曼等级(rs)之间存在明显的相关性测试检测到的相关组织。空间相互作用和二元点模式分析是由电脑点模式生成和圆形社区分析(闭路;Medetect)和通过蒙特卡罗模拟测试(ImageJ v1.51S,国家卫生研究院的贝塞斯达,医学博士,美国)和马赛克交互分析插件。对老鼠的实验中,一个未配对t检验发现感染病毒的小鼠组之间的差异。皮尔森参数相关性和线性回归确定eotaxin信使rna病毒与组织相关的内容。
结果
额外的结果了补充材料(表E2、数字E1-E4)。
组织嗜酸性细胞和嗜碱性细胞的渗透在COPD发生在所有主要解剖肺区域
开展航空公司
包含IHC显示支气管嗜酸性细胞和嗜碱性细胞分散在大多数病人。然而,更密集的嗜酸性粒细胞在场只有在病人的一个子集和统计密度增加而控制或温和的疾病只有在晚期(黄金IV)慢性阻塞性肺病(图1和2)。虽然小于嗜酸性粒细胞,嗜碱细胞计数显著增加在慢性阻塞性肺病(图1)。有趣的是,上皮嗜碱粒细胞几乎没有在控制和轻微的疾病,有一个倾向增加黄金ii iii和明显调节静脉病人。同样,密度的2型代理标记GATA3增加先进的疾病(图1 c)。气管支气管(大)显示类似的高嗜酸性粒细胞,嗜碱细胞和GATA3浓度从相同的黄金IV病人(细支气管补充图E2c)。活检军团,嗜酸性细胞和嗜碱性细胞在统计学上增加集中黄金》患者与不吸烟者相比,但不吸烟控制(补充图ea2和b)。
组织嗜酸性粒细胞和嗜碱细胞渗透空间联系在一起
之间的统计相关性显著嗜酸性粒细胞和嗜碱细胞密度在同一组织内环境,在这里表示2-4-cm的2手术切除。这种相关性在场中央气道(支气管)和远端肺隔间,如小航空公司(细支气管),总周围肺组织和肺泡薄壁组织(图4)。
积累tissue-infiltrating嗜酸性粒细胞在慢性阻塞性肺病是零零碎碎,集中在空间不同的Th2微环境
嗜伊红的微环境与本地化GATA3签名
重复染色进一步显示,存在不同的eosinophil-rich微环境伴随着焦点聚集的嗜碱粒细胞和GATA3+细胞(图5一个和c)。一个空间统计分析方法被用来量化GATA3的密度+细胞内部和外部的嗜酸性粒细胞微环境(补充图E1)。嗜酸性粒细胞肺样本的片状GATA3的密度和集群+细胞显著和多方面的更大的嗜酸性粒细胞周围微环境与non-neighbourhood区域(图5 b)。证实了一个空间GATA3-eosinophil关系模式蒙特卡罗模拟(p < 0.001)。
ILC2和Th2在嗜酸性粒细胞淋巴细胞微环境
ILC2细胞可以代表当地2型细胞因子来源,促进当前类型的局部嗜酸性粒细胞。我们独特的ILC2染色协议显示清晰的本地化ILC2细胞嗜酸性粒细胞疫源地内(图6)。正如所料,ILC2比经典的CD4计数明显降低+Th2细胞ILC2之和的ILC2分数和Th2细胞eosinophil-rich患者±刻薄sd3.5±3.8%。值得注意的是,ILC2气道上皮细胞的比例为15.5±18%的ILC2和Th2细胞的总和。
探索呼吸道病毒感染的潜在原因零零碎碎,空间独特的嗜酸性粒细胞肺组织中积累
我们的研究结果,从探索肺组织中嗜酸性粒细胞反应验证鼠标恶化与吸烟和/或流感感染模型,表明病毒感染导致一个健壮的嗜酸性粒细胞浸润(图7和补充图E4d)。生成的嗜酸性粒细胞是零零碎碎,colocalised片状感染(流感的存在)描述在目前的模型(图7)[21]。老鼠接触烟草烟雾之前没有类似的嗜酸性粒细胞反应在感染(山图7)。的发展似乎涉及influenza-induced嗜酸细胞增多症介质IL-33 / ST2轴,IL-33嗜酸性粒细胞没有出现占据−−/老鼠(图7)我)。本身的淘汰赛IL-33显著减少嗜酸性粒细胞的低级基线存在未感染野生型小鼠(图7)(二)。
COPD-affected肺部和感染病毒的小鼠显示本地化eotaxins的表情
Eotaxins是迁移的关键化学引诱物和组织嗜酸性粒细胞的归航。结合伊什+包含IHC被用来揭示eotaxin-expressing细胞的存在和身份在COPD患者和感染病毒的老鼠。病毒感染小鼠引起的强大和重要upregulation肺总CCL11和CCL24 (图7 b)。CCL11的表达是不同的,局限于大血管周的结构细胞(图7 c和d)和主要局部感染和eosinophil-rich肺区(图7 c和d)。比CCL11 CCL24更广泛的分布和最重要的局部肺泡内巨噬细胞感染和eosinophil-rich肺区(补充图E4c)。
在人类慢性阻塞性肺病组织,CCL11变量和不完整的本地化,细长呈(波形蛋白的表达的一个子集+)结构的细胞。与小鼠相比,人类COPD-affected CCL11肺局部主要是气道或腺上皮(下图6 b),这也是最突出的网站嗜酸性粒细胞集群。主要是CD68 CCL24-expressing细胞+肺泡巨噬细胞(图6 c),没有视觉上明显colocalisation嗜酸性粒细胞集群。
讨论
本研究揭示了一些新的方面的嗜酸性细胞、嗜碱性细胞在慢性阻塞性肺病和Th2免疫,尤其是缺乏均匀性炎症COPD-affected肺。这项研究排除任何特异反应性或患者过敏史。因此,数据的本质揭示COPD-specific嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞Th2免疫的紧张调查目前在慢性阻塞性肺病和nonallergic哮喘表型。有趣的是,eosinophil-high COPD已经证明显示组织病理学特征通常归因于嗜酸性哮喘,如网状层的基底膜增厚23]。这引发了共享底层2型机制的可能性。因此,尽管我们对慢性阻塞性肺病的诊断很有信心在这项研究中,我们承认它的定义和相关的复杂性之间的鉴别诊断nonallergic嗜酸性哮喘与固定障碍物,eosinophil-high慢性阻塞性肺病和asthma-COPD重叠综合症(24]。
高嗜酸性粒细胞和嗜碱细胞数量观察慢性阻塞性肺病患者接受高剂量吸入激素治疗有非常严重的疾病进一步支持观察哮喘,nonallergic嗜酸性粒细胞比经典抗类固醇allergen-induced嗜酸性粒细胞。此外,这个同意报告,肺泡一氧化氮浓度更高级的COPD患者的增加,表明增加nonallergic 2型信号在远端航空公司(25]。COPD患者的类固醇敏感问题是复杂的观察血或痰嗜酸性粒细胞在温和的疾病增加响应的指标(26,27]。值得注意的是,在我们sub-biopsy研究中,嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞也增加了温和的疾病。然而,因为没有完美的控制患者年龄和性别匹配,这个结果进行解释时应特别谨慎,应该注意的是,我们研究的样本量不允许任何结论类固醇响应能力。
先前的研究已经发现嗜伊红血球过多是一个重要的功能的一个子集(慢性阻塞性肺病患者6]。在目前的研究中,只发现在统计增加嗜酸细胞增多症非常严重的慢性阻塞性肺病。应该注意的是,所有的黄金四期患者停止吸烟,而当前吸烟者∼40%的温和的患者。因此,因为烟雾暴露可以抵消2型反应(这是由目前的老鼠实验),它不能被排除在外,持续吸烟可能导致较低的嗜酸性粒细胞中观察到温和的疾病。此外,本研究设计无法通知到什么程度发生在瞬态嗜酸细胞增多症加剧黄金阶段》的病人。小说的研究发现是解剖学上普遍嗜酸性粒细胞浸润,包括所有主要的解剖室COPD-affected肺。结果补另一项研究报告,COPD患者和血液嗜酸性粒细胞计数(> 250个细胞·µL−1)有相应的更大的痰和支气管肺泡灌洗嗜酸性粒细胞计数的患者相比较小·µL血液嗜酸性粒细胞计数(< 150细胞−1)[28]。这些嗜酸性COPD患者也增加了各肺嗜酸性粒细胞的位置和更大的组织改造(28]。除了之前确定腔的嗜酸性粒细胞和支气管在nonallergic COPD患者(9,29日,30.),嗜酸性粒细胞在细支气管慢性阻塞性肺病可能发挥效应的功能,肺泡实质和异位淋巴聚集。
另一个重要的观察是嗜酸性粒细胞显示明显的分布和不同的破碎在微环境水平。这表明底层,但不明,导致nonallergic嗜酸性粒细胞的COPD患者可能来自外部源的高度本地化的方式行动。这也意味着诱发的免疫反应和体现嗜伊红血球过多也可能是高度本地化。这是我们找到一个明确的空间支持的嗜酸性粒细胞和代理之间的关系2型GATA3标志。2型细胞因子表达GATA3至关重要生产Th2淋巴细胞和ILC2细胞(31日- - - - - -33),目标是打击2型免疫在诊所(30.]。因此,它是重要的发现不仅GATA3+Th2细胞而且GATA3+ILC2细胞识别eosinophil-rich口袋里。ILC2细胞生产能力2型细胞因子曾被证实在COPD肺小(∼CD45的0.05%+细胞),但可能生物相关的数字(34]。在协议中,我们的研究显示一个明确的主导地位的Th2细胞在ILC2s数字,尽管ILC2 / Th2比率只有∼1:6上皮衬里。
我们发现高度本地化的Th2和eosinophil-rich口袋COPD-affected肺是概念上的小说,和一个重要的评估患者的炎症状态未来的挑战。例如,表明血或痰嗜酸细胞增多症嗜酸性粒细胞组织的存在,但并不排除这种可能性很大一部分或其他肺部区域会有一种天生的巨噬细胞和neutrophil-rich或1型辅助细胞类型的炎症。它标志着一个重大的挑战未来改进的个性化治疗和2型机制有助于理解目标的挑战在COPD肺。
同意发表的研究在人类和老鼠表明病毒感染可以引起短暂的嗜酸性粒细胞(35- - - - - -37嗜酸性粒细胞),这项研究证实了强劲发展后流感感染小鼠肺。在我们的实验模型进一步揭示这嗜酸性粒细胞反应高度参差不齐,与空间相关的局部eotaxin响应和依赖IL-33释放,如IL-33嗜酸性粒细胞没有出现−−/老鼠。此外,在协议与实验心肌炎模型(38),我们结合伊什和包含IHC透露CCL11表达的是最重要的成纤维细胞和巨噬细胞周而CCL24是局部的。我们的实验数据,以及病毒感染是常见的事实在慢性阻塞性肺病急性加重(39],提出的局部感染作为一个可信的触发的小说类型的片状2型,eosinophil-rich口袋。的确,我们的数据表明,不完整的嗜酸性粒细胞在先进的疾病更为常见,这期间患者出现更多的感染与早期相比39]。然而,限制我们的研究是患者团体相对较小,嗜酸性粒细胞和参差不齐的感染性原因的证据是间接的。更大规模的研究涉及到更大的群体和更广泛的微生物(细菌和病毒)评估从而保证。
此外,这项研究是第一个系统的映射tissue-infiltrating嗜碱粒细胞在慢性阻塞性肺病。总之,与嗜酸性粒细胞嗜碱细胞密度相关。然而,由于嗜碱粒细胞几乎没有控制的情况下,增加的相对大小是大于通常观察到许多其他免疫细胞。有趣的是,类似于观察哮喘(40),嗜碱粒细胞的组织密度与疾病严重程度增加。渗透的优惠网站是异位在远端肺和淋巴组织开展航空公司,例如,在小气道上皮内嗜碱粒细胞显示大幅增加黄金IV型患者。这种渗透模式兼容的现代观点嗜碱粒细胞强有力的免疫调节剂和宿主防御细胞(41,42]。例如,嗜碱粒细胞可能放大局部il - 4分泌物(2型反应11,43),由IL-33激活和胸腺基质淋巴细胞生成素,可以释放多种炎性因子除了组胺。最近实验模型,嗜碱粒细胞在肺气肿发展已确定有作用[44),他们也与防御COPD-relevant细菌和病毒(41]。嗜碱粒细胞可能因此,旁边有害致病能力,也起到了保护作用。在任何情况下,目前的研究表明,嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞等表达IL-5Rα,应该被视为一个潜在的相关目标IL-5 IL-5Rα-targeting疗法。
还有待探讨嗜酸性粒细胞在慢性阻塞性肺病组织在多大程度上接受零散的脱粒,编程细胞溶解或继发性坏死(43,45]。高架free-granule蛋白质在支气管肺泡灌洗液或痰液样本在哮喘和慢性阻塞性肺病经常被视为积极的脱粒的标志(46解放,但鲁米那粒蛋白质是明显造成的管腔内的坏死的机制。不幸的是,我们的样品是不适合电子显微镜,防止脱颗粒状态的超微结构分析,和慢性阻塞性肺病组织嗜酸性粒细胞的活化状态也还有待确定。
总之,本研究确定了在慢性阻塞性肺病嗜碱粒细胞具有潜在的作用,表明组织嗜酸性粒细胞在慢性阻塞性肺病是解剖学上普遍但通常局限于不同Th2-skewed和ILC2-containing微环境。这个特性的组织嗜酸性粒细胞可能具有临床意义。此外,我们的数据表明呼吸道感染的潜在触发的嗜酸性粒细胞在慢性阻塞性肺病。
补充材料
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确认
我们感谢Karin Jansner (Medetect AB,隆德,瑞典)和Britt-Marie尼尔森(单位气道炎症,隆德大学,Lund),熟练的组织准备和组织工作。编辑支持,作者的方向和指导下,和手稿提交由黛布拉斯盖茨(,JK Associates Inc .肯肖霍肯的PA,美国)和迈克尔·a·尼森(美国马里兰州盖瑟斯堡,阿斯利康,)。这是由阿斯利康的支持。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
利益冲突:p . Jogdand没有披露。
利益冲突:p . Siddhuraj没有披露。
利益冲突:m . Mori没有披露。
利益冲突:c . Sanden没有披露。
利益冲突:j·琼森没有披露。
利益冲突:自动跟踪墙壁没有披露。
利益冲突:j . Kearley是阿斯利康(原名MedImmune LLC)的员工,在阿斯利康股票期权。
利益冲突:嗜教训了阿斯利康(原名MedImmune LLC)的员工进行了这些分析。
利益冲突:r . Kolbeck是阿斯利康的员工(原名MedImmune LLC)进行了这些分析。
利益冲突:l . Bjermer没有披露。
利益冲突:p·纽伯尔德是阿斯利康(原名MedImmune LLC)的员工,在阿斯利康股票期权。
利益冲突:j.s Erjefalt Medetect AB的创始人(和股票所有者),接受资助阿斯利康进行本研究的部分。
支持声明:本研究经费是由阿斯利康,瑞典的心脏和肺脏基金会和瑞典研究理事会。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2019年1月15日。
- 接受2020年2月6日。
- 版权©2020人队
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