国际共识指南报告透射电子显微镜结果诊断原发性纤毛运动障碍(击败PCD TEM标准)
- 阿米莉亚Shoemark1,2,
- Mieke恩惠3,
- Christoph Brochhausen4,
- Zuzanna Bukowy-Bieryllo5,
- 玛丽亚·m·德·桑蒂6,
- 帕特丽夏郭金7,
- 保罗·格里芬1,8,
- 理查德·g·Hegele9,
- 罗伯特·赫斯特10,
- 玛格丽特·w·利11,
- 艾莉森•勒普顿12,
- 凯伦MacKenney13,
- Heymut奥木兰·14,
- 特里Pache15,
- Andreia平托16,
- 芬恩p Reinholt17,
- 约瑟施罗德4,
- Panayotis Yiallouros18和
- 埃斯特尔Escudier19
- 代表BEAT-PCD网络指南开发集团1
- 1英国伦敦皇家主管布朗普顿医院地铁站
- 2医学院的英国邓迪大学,邓迪,
- 3鲁汶大学医院儿科部门,比利时鲁汶
- 4德国雷根斯堡大学病理学研究所Regensberg
- 5人类遗传学研究所波兰科学院,波兹南,波兰
- 6部门的病理学、锡耶纳大学医院,锡耶纳,意大利
- 7南安普顿大学医院NHS信托基金会,南安普顿,英国
- 8澳大利亚墨尔本皇家儿童医院
- 9医院Children-University多伦多,多伦多,加拿大
- 10呼吸系统科学部门,莱斯特,英国莱斯特大学
- 11儿科和Marsico肺癌研究所的部门,北卡罗莱纳大学教堂山分校,数控,美国
- 12病理部门、大格拉斯哥和克莱德,伊丽莎白女王大学医院,英国格拉斯哥
- 13新南威尔士健康病理学,康科德遣返总医院,澳大利亚悉尼
- 14大学医院的儿科医学部门卓卓德国
- 15日内瓦大学医院,瑞士日内瓦
- 16皇家研究院药物分子,葡萄牙里斯本
- 17奥斯陆大学医院,挪威奥斯陆
- 18大学医学院塞浦路斯尼科西亚,塞浦路斯
- 19巴黎索邦大学,将进医学院学习,INSERM UMR_S933, (APHP)援助Publique Hopitaux巴黎别致(de完成社团之间的中心),巴黎,法国
- 阿米莉亚Shoemark、原发性纤毛运动障碍中心、儿科呼吸医学、皇家主管布朗普顿医院,地铁站悉尼街,伦敦,英国SW3 6 np。电子邮件:a.shoemark在{}dundee.ac.uk
文摘
原发性纤毛运动障碍(PCD)是一种异构的遗传疾病。欧洲和北美的诊断指南建议透射电子显微镜(TEM)之一的组合测试,以确定诊断。然而,所包含的内容的定义没有一个缺陷或共识报告术语。这个项目的目的是提供一个国际商定由TEM超微结构金刚石诊断分类。
金刚石电子显微镜专家共识指南是由来自14个国家的18个中心的。最初的会议和讨论,后跟一个Delphi共识的过程。同意指导测试,修改和重新测试通过交换之间的样本和电子显微图18诊断中心。
最后指南)提供同意术语和定义的类1缺陷诊断金刚石;b)标识类2缺陷也可以表明金刚石与其他证据相结合的诊断;c)描述特性应该被包括在纤毛超微结构报告,协助多学科诊断原发性纤毛;和d)定义了适当的诊断样本。
这个测试和外部验证语句提供了明确的指导方针为PCD的诊断TEM可以用来国际标准化的诊断。
文摘
这个测试和验证共识声明提供了明确的术语和缺陷定义的超微结构诊断原发性纤毛运动障碍(PCD)。指导方针将促进纤毛运动研究和诊断的标准化。http://bit.ly/2RDkz7k
介绍
原发性纤毛运动障碍(PCD)是一种异构的遗传条件影响1:10 000的人口1]。通常开始在生命的早期,症状包括慢性咳嗽鼻涕又湿,进步在儿童上呼吸道和下呼吸道反复感染和最终的支气管扩张(1]。纤毛也出席了胚胎节点,节点纤毛的缺陷可能导致异常的左右一侧的决心(位置异常)。
PCD的诊断通常依靠的组合测试因为一个测试不能可靠地诊断所有纤毛运动类型。这些测试可能包括鼻一氧化氮测定(2),评估纤毛波形的高速视频显微镜(3),免疫荧光(如果)分析纤毛蛋白(4)、透射电子显微镜(TEM)和基因测试。欧洲和北美的诊断准则不同建议的诊断测试,虽然都同意的评估纤毛超微结构通过TEM和/或bi-allelic突变一个已知的PCD金刚石诊断基因确定(5- - - - - -7]。然而,有相当大的异质性在病理报告描述PCD和解释什么是诊断缺陷。纤毛基因丝的缺陷可以继发于感染或炎症气道粘膜,或样本中没有充分准备。报告和解释结果的差异可能导致误诊。
近年来,基因检测和分子生物学的进步已经重新定义了PCD的许多方面,同时提高对基础科学的理解进一步复杂的传统电子显微镜的使用术语。例如使用术语“径向说缺陷”被用来形容中央复杂的缺陷,比如那些所致RSPH4A突变和微管扰乱缺陷所致CCDC39突变(8- - - - - -11]。在其他临床实体,如移植肾病理、国际商定的病理学分类称为“班夫标准”已经证明可以显著提高诊断精度、再现性和疾病的结果(12,13]。目前项目的目的是提供一个国际商定的超微结构的分类诊断金刚石,金刚石通过定义的缺陷诊断描述特性在一份报告中应该包括协助金刚石和定义适当的多学科诊断的诊断样本。
方法
指南开发
指导开发过程所示图1。一群电子显微镜专家们代表了18个中心14个国家(澳大利亚、比利时、加拿大、塞浦路斯、法国、德国、意大利、挪威、波兰、葡萄牙、西班牙、瑞士、英国和美国)在人,认识的通过视频链接开发共识声明报告纤毛超微结构通过TEM成本行动BEATPCD会议。从这个会议记录被用来创建共同的主题和识别项的德尔菲调查共识。Delphi的共识与旨在调查包括三轮:1)定义缺陷诊断金刚石;2)描述特性在一份报告中应该包括协助多学科诊断原发性纤毛;和3)定义适当的诊断样本。普遍被认为是实现如果超过80%的参与者表示同意。与更广泛的磋商BEATPCD社区是在下一次BEATPCD会议上进行的。
指导验证
一旦指南草案完成一系列TEM部分分布在组织和指导测试和修改不一致和清晰。代表一组16例病人的基因诊断证实PCD金刚石被用于或最终没有指导验证。四个中心被分配四个案例从以下准备:CCDC114,CCDC39,CCDC40,CCNO,DNAAF1,DNAAF3,DNAH5,DNAH11,DRC1,RSPH4A、囊性纤维化(CF)、健康志愿者(×2),样本(×2)不足,影响患者PCD的兄弟姐妹。中心在南安普顿(英国)、多伦多(加拿大)、巴黎(法国)和门斯特干酪(德国)切割并且彩色四个网格从4例。这些网格被送往伦敦他们质量检查、匿名、随机和分布式个人没有共识集团的一部分。17个中心然后收到四个网格和一个中心收到图片(中心没有收到自己的网格)。
所有17个中心评估了四个网格,每个中心使用自己的技术制作和解读图像,而18中心收到图片。中心完成了报表基于共识声明并返回代表图像。缺陷的形式包括类,超微结构的缺陷,充足的样本,总结重要发现。一个中心了配送中心在伦敦拍摄的图像,而不是网格,由于技术上的困难。
验证的结果讨论了运动的面对面会议。一个额外的在线调查从这次会议分布式澄清点和相应的指导修改。指导调查结果可以发现和验证补充材料。
最后从病例图像CCDC39,DNAAF3,DNAH5,RSPH4A和CF被用来评估修改后的指导完成。这个验证练习完成了所有共识声明作者和六个额外的电子显微镜化验员没有直接参与开发共识声明。
结果
本指南描述了评估和报告的纤毛上皮样在戊二醛固定,脱水,嵌入在树脂和沾重金属(柠檬酸铅和醋酸双氧铀或等效)。
正常的呼吸道纤毛超微结构
至关重要的共识组确定观察者熟悉的外观正常的纤毛超微结构和纤毛运动缺陷从广泛的样本,使用本地采样、处理和可视化方法,才开始诊断测试金刚石。图2显示正常的健康的呼吸道纤毛超微结构。能动的纤毛的基因丝是由著名的9 + 2结构,在九个外围环绕中央的单一微管微管对比。每个微管紧身上衣与中央对径向辐条和邻近nexin微管的句子连接的动力蛋白监管复杂(N-DRC)。外微管的句子包含定期重复的钩状结构被称为外动力蛋白臂(oda)和内在动力蛋白臂(ida),负责代纤毛运动通过atp酶活性。基本单位重复沿着基因丝大约每96海里。每个紧身上衣都包含在96 nm重复,四个双头oda,六种不同的单头IDA和一个双头IDA同种型,一个N-DRC和三个径向辐条(14- - - - - -17]。重复的差异这些单位和密度的结果在TEM不同的对比。电子密度ODA更容易想象在70 - 100 nm TEM部分比密度较低,IDA N-DRC因为ODA动力蛋白重链片内的存在。技巧和基本的纤毛超微结构是不同的,这个应该考虑当评估金刚石的缺陷。
1类和2类缺陷,术语,适当的采样和共识的定义由TEM PCD的诊断
专家共识小组确定了金刚石TEM诊断缺陷两类:第1类缺陷,被认为是“标志”缺陷确认诊断病情的患者症状;和二班缺陷,这表明金刚石的患者临床症状的诊断条件如果一致的跨多个样本或细胞培养后,如果与其他测试结果一致。所示的两个类缺陷表1并在文本中定义。该组织决定区分两类缺陷因为类1缺陷诊断而类2缺陷可以更加难以识别和类似于二次缺陷。
1级缺陷
类1缺陷诊断的PCD病情的患者临床症状。类1缺陷评估后确认50多个我横切面从几个细胞。应该小心评估从近端横截面(microvili的区域)和远端区域的基因丝。动力蛋白臂应评估在横截面与清晰的结构特点和一个完整的纤毛膜。微管排列可以评估在一个更大的一个完整的膜的横截面的动力蛋白臂可能并不明确。1级缺陷所示的例子图3。
ODA缺陷
缺乏的全部或一个更大的部分ODA多数(5或更多)的结构中微管对比绝大多数(50%以上)的纤毛横截面。ODA的缺陷源于突变基因编码结构蛋白(例如DNAH5)和ODA对接蛋白(例如CCDC151)。如果分析通常显示了一个缺乏外部动力蛋白重链蛋白质DNAH5。
特战分队和IDA缺陷
缺乏的全部或一个更大的部分ODA多数(5或更多)的结构中微管对比绝大多数(50%以上)的纤毛横截面和缺席的或更大的一部分IDA多数(七个或更多)的结构中微管对比绝大多数(50%以上)的纤毛横截面。如果艾达的数量不能准确地确定,样品应报告为“ODA缺陷(+ / - IDA缺陷)”。这些缺陷通常是由基因突变在动力蛋白组装。如果分析显示缺乏蛋白质DNAH5和DNALI1等。
微管杂乱无章和IDA缺陷
9 + 2对称的破坏微管在25%以上的横截面结合缺乏IDA结构的全部或一个更大的部分的多数(超过7)中微管对比绝大多数(50%以上)的纤毛我想起在横截面。缺陷几乎总是来自CCDC39或CCDC40突变(7]。如果在这些情况下分析显示一个缺乏N-DRC蛋白质如GAS8和IDA DNALI1等蛋白质。
二班的缺陷
二班的缺陷可以表明金刚石的患者临床症状的诊断条件如果跨多个样本保持一致并符合其他结果(如那些如果,高速视频显微镜或遗传分析)。他们可能需要评估的纤毛我超过1级缺陷。应该小心评估几个细胞的横截面和近端(在该地区microvili)和远端区域的基因丝。动力蛋白臂应评估在横截面与清晰的结构特点和一个完整的纤毛膜。微管排列可以评估在一个更大的一个完整的膜的横截面的动力蛋白臂可能并不明确。二班的缺陷所示的例子图4。
中央复杂的缺陷
中央复杂缺陷比例由一个正常的横截面和一致的横截面与中央微管的一个或两个缺席(通常超过20%)。偶尔的双核心双或易位外微管的中部地区(“8 + 1”模式)可以看到。发生易位通常接近纤毛小费。在纵向的章节中,间歇性或完全丧失中央副或换位的外紧身上衣也可以看到。经常看到一些微管杂乱无章。这些TEM结果报告与遗传缺陷有关的径向说组件(例如RSPH4A,RSPH1,RSPH9和DNAJB13)[18- - - - - -20.),可以确认如果径向说话头蛋白质。在某些情况下高速视频显微镜观察时可以显示纤毛盘旋。
Mislocalisation基底的身体很少或根本没有纤毛
发现通常没有或很少有纤毛的横截面结合的失败大部分基底身体停靠的顶端表面细胞,这意味着他们一直在细胞质中。这些发现与基因变异有关CCNO和MCIDAS和只有少数纤毛每个细胞由高速视频显微镜(21,22]。遗传缺陷导致减少代多个能动的纤毛。罕见的形象化的纤毛,基因丝的超微结构CCNO情况下可以正常但在个人MCIDAS突变可以缺乏官方发展援助。
微管杂乱无章
一致的破坏微管杂乱无章表示的9 + 2对称微管的横截面在健康样本。的缺席N-DRC链接有时指出;然而,大多数的横截面通常有正常的超微结构和oda ida礼物。这些发现可能与突变有关CCDC65,DRC1和GAS8编码N-DRC蛋白(23- - - - - -25]。微妙的节奏模式异常包括快速或破坏模式和缺乏N-DRC蛋白质如GAS8如果在这些情况下观察到。IDA是出现在超过50%的横截面,区分这种情况下从类1微管杂乱无章和IDA缺陷。
透射电子显微镜纤毛的报告
TEM报告应当符合总则的良好实践病理报告,如下:1)应该清楚和准确的报告和总体结果或结论必须清晰可见;2)病人必须确定所写的报道,至少有两个独特的项目信息(如。全名和出生日期);3)必须声明如果测试是不完整的和/或最低质量不是实现;和4)金刚石测试应该是明确的人接收报告,正常的超微结构不排除诊断。项目专家组同意的必要和可取的一个电子显微镜在介绍了PCD的诊断报告表2。
指南开发调查结果的总结
在圆形,共识得到缺陷所示三个特点表1和参与者建议定义。超过80%同意以下类2缺陷:中央复杂的缺陷,mislocalisation基底的身体很少或根本没有纤毛,ODA缺席25 - 50%的横截面,并结合IDA和ODA缺席25 - 50%的横截面。微管杂乱无章被添加到该列表后,验证运动。项目包括在一份报告中也同意(表2)。集团没有达成共识下列事项为第1类或2类缺陷和包含或排除这些应该在观察者的自由裁量权作为证据可用:孤立的IDA缺陷(30.],ODA损失小于25%的横截面,ODA和艾达损失小于25%的横截面,取向缺陷(31日- - - - - -33)和纤毛长度的缺陷。未来的研究应该关注这些缺陷的相关性和准则应相应更新。在轮2和3,定义特征的缺陷是同意的标准样本充足(即。50多个横截面与完整的纤毛膜)。详细的给出指导开发过程补充材料。
指导验证结果的总结
两轮进行了验证,有100%参与这个活动(在所有18中心)。在圆一个没有假阳性诊断(即。没有non-PCD样本划分为类金刚石缺陷1标志)。17 68节(25%)被描述作为评估不足或不足。其中包括100%的回报CCNO病例和75%回报一个示例包括作为样本不足。25的25例(100%)被正确识别为类1标志缺陷;然而,25岁的回报(32%)为1级缺陷记录一个错误的名称。两种情况被描述为上课1缺陷当他们有一个类2缺陷或正常的超微结构。5 6例正确认定为二班的缺陷。二班四个正常的超微结构例错误地认定为缺陷。
指导修改,在第二轮没有假阳性诊断(即。没有non-PCD样本划分为类金刚石缺陷1标志)和正常的超微结构被确定通过18 18个中心。没有假阴性,有100%正确的识别类1特征的缺陷。其中包括18的18正确确定微管杂乱无章+ IDA缺陷,17 18 ODA的缺陷(一个是判断作为ODA + IDA缺陷)和17 18 ODA + IDA缺陷(一个是判断作为ODA缺陷)。此外,有100%正确识别类的2缺陷。十五18正确认证中心的复杂的缺陷,而三个判断这是微管杂乱无章(因此强调的重要性额外的证据要求类2缺陷)。94%的评论者给一个正确的超微结构缺陷根据基因诊断。观察者之间的协议(κ)0.76 - -1.0(0:没有协议,1:完成协议)。外部验证进一步六电子显微镜专家给出了指导阅读,然后完成了图像验证。所有六个观察员确认正确的所有情况下超微结构的缺陷。
讨论
下一代测序和分子进步导致快节奏的改进金刚石近年来诊断的。TEM是有价值的在维护和/或确诊纤毛,基因测试指南,有清晰的超微结构缺陷和影响基因的组织之间的联系。这是特别有用,当变异识别未知的意义。致病基因突变在已知纤毛目前只占65 - 75%的情况下金刚石证实了TEM的。表的TEM表型基因型是可用的补充材料。我们提出的第一个国际商定的准则报告原发性纤毛活检诊断。这条指导原则的目的是成为一个灵活的配方,它需要更新和演变的新证据。这些建议是最低要求和专业判断和经验在许多情况下是至关重要的。
纤毛超微结构正常
这一再被证实诊断的准确性TEM不足以排除诊断,多达30%的纤毛运动情况下被描述为正常或接近正常的纤毛超微结构(34- - - - - -36]。这包括缺陷的大型动力蛋白重链,DNAH11占大量的情况下(37,38]。在另一组患者中,可以看到细微的超微结构变化,但这些non-diagnostic (如。缺陷HYDIN影响中央对c2b投影)[39]。当前语句引入了类的概念2缺陷解决局限性的细微变化的识别。二班缺陷支持诊断,但不应使用没有其他诊断测试。许多二班缺陷变化是次要的致病分子缺陷(如。径向说话头中央对基因缺陷导致二次损失)[19]。二班必须要强调的一点是,一些缺陷,如果没有证实在第二个样本或细胞培养后,也可能是non-PCD相关原因的结果。
电子显微镜的诊断PCD的局限性
最初的验证指南显示,小,样本不足(见最可能导致误诊补充材料)。同样清楚的是,个人处理技术,熟悉当地出现纤毛至关重要的解释。由于设备可用性的差异和本地程序目前还不可能标准化方法在样本处理和可视化。在未来,达成共识的方法可能是发达;然而,我们已经解决了方法论的差异,建议广泛的正常和纤毛运动呈现样品使用本地技术在诊断样本解释。
二次纤毛超微结构的缺陷可能是由于急性或慢性呼吸道感染、炎症性呼吸道疾病(即。哮喘)、环境和人口因素(吸烟,污染和年龄),或样品处理40]。通常观察二次缺陷样品检验通过TEM (如。微管缺陷,已观察到10%的健康对照组)[41,42]。次要缺陷的外观可以重叠的出现积极的纤毛运动情况下(如。微管杂乱无章和中央对异常)。误解这些缺陷可以预防的照顾,以避免抽样当病人不适,使用从呼吸道上皮细胞培养(气液界面或球体文化)删除条件导致继发效应,考虑个人的健康细胞样本,通过重复活检(43,44]。偶尔,确保二次缺陷样本不偏见的解释,我们建议的评估至少50我横切面从许多不同的细胞。我们建议应该评估动力蛋白臂横截面与清晰的结构特点和完整的纤毛膜。微管排列可能评估更多的横截面与完整的膜,动力蛋白臂是不清楚的,虽然应该避免不健康的细胞或复合纤毛。二班的缺陷我们建议评估多个样本或细胞培养。派拉蒙的一致性是一个类2缺陷与其他测试的结果,如高速视频,如果分析,鼻一氧化氮测定和基因分型。
总结
TEM金刚石的性能诊断(即。敏感性和特异性)难以准确评估时没有同意诊断标准。这一共识声明测试和验证,并提供一个清晰的指导金刚石通过TEM的诊断,也可用于国际标准化的诊断。
补充材料
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确认
一个代表作者/中心(通常个人评估和报告TEM,代表每个中心的意见通过完成德尔菲调查)已包括在这份报告的作者。然而,一些额外的专家参加了会议,评论这一共识声明和贡献他们的专家意见和技术技能在其发展。我们要感谢:Sverre-Henning Brorson,汤姆·伯戈因克鲁利苏珊娜,克里斯•奥卡拉汉Mellisa迪克逊,里根多尔蒂,凯瑟琳Faucon,保罗•弗伦奇(Paul French Raffaella Guazzo,紫杉孟亨,克莱尔·霍格Merete Helgesen,路易丝·休斯,马蒂娜雅斯贝尔斯Panayiotis Kouis, Kyriacou Kyriacos,简卢卡斯,弗吉尼亚曼奇尼,保罗•Martinello Rana米特里,埃琳娜·莫雷蒂,何塞·莫拉Nunes,安东页面,菲尔·罗宾逊,安娜Rowinska,安德鲁•Rutman海科Siegmund,珍妮弗·斯威尼,詹姆斯·汤普森和瓦莱丽Vlaeminck。此外,我们特别感谢Farheen Daudvohra匿名和随机试验部分和整理数据验证这条指导原则
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:这个项目是作为BEAT-PCD的一部分,进行多学科研究者和临床医生由欧盟资助的网络成本行动(BM1407)。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
利益冲突:a . Shoemark没有披露。
利益冲突:m .恩报告和STSM融资成本,在进行研究;外的拨款从地平线2020 MyCyFAPP,提交工作。
利益冲突:c . Brochhausen没有披露。
利益冲突:z Bukowy-Bieryllo没有披露。
利益冲突:M.M. De桑蒂没有披露。
利益冲突:p .郭金没有披露。
利益冲突:p·格里芬没有披露。
利益冲突:R.G. Hegele没有披露。
利益冲突:R.A.赫斯特没有披露。
利益冲突:M.W.利没有披露。
利益冲突:a。勒普顿没有披露。
利益冲突:k MacKenney没有披露。
利益冲突:h .奥木兰·没有披露。
利益冲突:j。Pache没有披露。
利益冲突:平托没有披露。
利益冲突:F.P. Reinholt没有披露。
利益冲突:j·施罗德没有披露。
利益冲突:p . Yiallouros没有披露。
利益冲突:大肠Escudier没有披露。
- 收到了2019年4月10日。
- 接受2020年1月24日。
- 版权©2020人队