抗生素疗效变化基于铜绿假单胞菌的感染模型和治疗方案
- 亚历山德拉Bragonzi、感染和囊性纤维化,免疫学,移植和传染病、圣拉斐尔科学研究所,米兰,意大利。电子邮件:bragonzi.alessandra在{}hsr.it
文摘
抗生素的发现和临床前测试需要战斗铜绿假单胞菌健康威胁。最频繁、抗生素疗效测试模型的急性呼吸道感染、慢性肺炎的未知。这种方法产生的严重担忧的评价治疗慢性感染患者,并强调需要模拟人类疾病的动物模型。
在这项研究中,销售抗菌药物的疗效妥布霉素(TOB)和粘菌素(COL)在急性和慢性的小鼠模型进行测试铜绿假单胞菌肺部感染。不同的管理路线(鼻内,气溶胶或皮下)和治疗计划(很快或感染后7天)进行了测试。
在急性感染模型中,气溶胶和皮下TOB负担减少了细菌和炎症反应,而鼻内治疗显示适度的功效。坳减少细菌负担不那么有效但抑制炎症。小鼠慢性感染后的7天每天气溶胶或皮下TOB显示更高和更快速的体重恢复和减少细菌和炎症负担比vehicle-treated老鼠。COL-treated小鼠体重没有改善或改变炎症。适度的细菌减少负担与气溶胶坳只记录管理。当治疗慢性感染后7天开始感染,钻头扭矩和坳未能减少铜绿假单胞菌负担和炎症,或帮助恢复体重。
我们的研究表明,动物模型和治疗方案应该仔细选择基于类型的感染抗生素疗效评估。
文摘
针对疾病的动物模型和治疗方案以优化反至关重要假单胞菌药物测试http://bit.ly/2ISfBiB
介绍
在世界范围内,呼吸道感染所致铜绿假单胞菌是一个最关键的医疗负担,每年六百万住院和四百万人死亡(1,2]。在免疫功能低下的人,铜绿假单胞菌可引起急性呼吸道感染导致败血症和死亡。囊性纤维化患者(CF)和non-CF支气管扩张、慢性危及生命铜绿假单胞菌感染和炎症导致肺功能进行性恶化[3,4]。尽管抗生素的使用,控制铜绿假单胞菌感染仍脆弱得不堪一击由于抗生素耐药性的快速崛起5- - - - - -7]。因此,铜绿假单胞菌感染是一个特别有关治疗挑战迫切需要实现的新型抗菌药物。
一个基本药物开发的先决条件是安全性和有效性的评估模拟人类疾病的动物模型。虽然有建立指导方针,指定适当的动物模型和参数评估抗生素相关安全,缺乏普遍接受的有效性测试指南(8,9]。最常用的动物模型评价抗菌药物的疗效铜绿假单胞菌繁殖的急性呼吸道感染免疫活性的或粒细胞减少性老鼠10,11]。然而,这些模型的特点是发病迅速,虽然有用,因为急性呼吸道感染模型,他们缺乏任何特征的事件引发的慢性感染。此外,使用粒细胞减少性老鼠不允许主机响应药物疗效的评估作为一个潜在的决定因素。
虽然慢性的小鼠模型铜绿假单胞菌肺炎已经生成模仿人类肺部病理学的高级阶段(10,12- - - - - -15),这些模型在技术上更复杂的比急性感染和带来一些挑战。在这些模型通常是由包括建立慢性感染细菌细胞在固定代理似乎在一个个独立王国在微氧/厌氧条件下生长,像在CF患者的粘液(16]。这些模型目前主要挑战与低有关铜绿假单胞菌负担和比例的受感染的老鼠周后感染(12]。尽管他们是有用的在评估重复政府的影响在慢性感染的发生和发展中,这些模型的临床前期成本会升高。因为他们没有使用系统特别是在基础平台上支持抗菌功效测试,他们的预测价值尚未完全建立。更重要的是,目前尚不清楚慢性感染,抗生素的使用模型的有效性测试铜绿假单胞菌是有益的和必要的相比,急性感染模型。此外,给药途径的影响和治疗计划可能在药物功效在很大程度上是未知的。
在这项研究中,我们的目标是定义小鼠模型之间的差异和治疗方案的疗效两个销售氨基糖甙类和多粘菌素类抗菌药物,妥布霉素(TOB)和粘菌素(COL)分别。我们设计研究1)评估治疗疗效急性和慢性的小鼠模型铜绿假单胞菌呼吸道感染;2)确定管理路线影响病原体间隙和主机使用气溶胶响应(航空),鼻内(i.n。)和皮下(南卡罗来纳州。)交付;和3)确定不同的治疗计划影响疗效,比较治疗管理很快感染后治疗慢性殖民期间管理。
方法
道德声明
动物研究坚持意大利卫生部实验动物的使用和护理指南(IACUC # 733和# 878)。研究与铜绿假单胞菌耐多药(MDR) -RP73隔离的CF个人和存储生物材料是汉诺威医学院伦理委员会批准的德国。
小鼠模型
免疫活性的C57BL / 6 ncrlbr雄性老鼠(8 - 10周;查尔斯河实验室、Calco、意大利)与1×10的挑战6菌落(cfu)浮游PAO1应变的急性感染或5×105cfu MDR-RP73应变嵌入在琼脂珠子的慢性感染气管内的政府(12- - - - - -14]。老鼠接受TOB,上校或车辆(水)由当地政府使用Penn-Century微灌®Aerosoliser (航空)或i.n。或系统南卡罗来纳州。管理局(图1)。体重每天监测。肺cfu和细胞计数支气管肺泡灌洗液(BALF)进行分析如前所述13,18,19]。细胞因子/趋化因子水平测定肺匀浆上清液的Bioplex化验(Bio-Rad实验室、贝、意大利)。药代动力学(PK)配置文件到陀伯地去和坳的肺部和等离子体铜绿假单胞菌来华的老鼠被高效液相chromatography-tandem质谱分析评估。更多细节按照动物研究:报告的在活的有机体内实验指南(20.)的报道补充材料。
统计数据
统计分析与GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)使用双向方差分析与Bonferroni多重比较测试体重变化和单向方差分析与Bonferroni多重比较检验其他读数。异常数据,确定格拉布的测试,被排除在分析之外。
结果
影响治疗效果的给药途径和类型抗生素在急性铜绿假单胞菌肺部感染
C57BL / 6 ncrlbr老鼠与浮游的挑战铜绿假单胞菌由气管内注射来PAO1应变诱导急性感染。局部治疗通过的航空或i.n。路线2 mg·公斤−1TOB或1毫克公斤−1上校和系统性治疗通过的南卡罗来纳州。路线与20 mg·公斤−1TOB或10 mg·公斤−1上校开始不久(5分钟)感染后(图1)。钻头扭矩和坳服用相同剂量麦克风比(补充表S1)和本地系统比基于以前的研究(17]。一剂TOB显著有效的6 h后处理,4-log10降低肺cfu航空政府和3-log10减少在南卡罗来纳州。政府与车辆(cfu观察相比,图2一个)。值得注意的是,TOB管理通过要么航空或南卡罗来纳州。路线能够完全清除感染治疗的至少一半的老鼠(补充表S2)。TOB显示细菌后间隙和低功效的能力有限i.n。管理、1-log10与汽车相比降低CFU CFU观察。坳普遍不如TOB有效减少细菌负担(图2 b)。COL-treated老鼠表现出显著降低细菌负担在肺部,₂10降低CFU后航空和南卡罗来纳州。与车辆管理相比,cfu观察,但是完全没有被观察到。没有减少观察肺cfu坳i.n。管理。总之,在急性感染,TOB和坳治疗管理通过的航空和南卡罗来纳州。路线降低细菌的负担,效果低于TOB坳。政府通过的i.n。路线是最有效的所有三个路线,上校没有明显的功效。
进一步解释这些结果,我们检查了PK的钻头扭矩和肺部和等离子体的上校铜绿假单胞菌来华的老鼠。大量的TOB集中和留存在本地(后的肺航空或i.n。)和系统(南卡罗来纳州。)行政管理局(后24小时图2 c)。这些数据支持系统的研究设计和当地比率。相比之下,出口浓度肺后的风险高航空管理,而不是南卡罗来纳州。或i.n。管理局(图2 d)。看有关的降低疗效TOB和坳(图2一个b),这些研究结果不支持直接效果之间的相关性(cfu /肺)和药物浓度肺(PK)。正如所料,等离子体浓度的钻头扭矩和卡扎菲都明显高于系统(南卡罗来纳州。),而不是本地(航空或i.n。)政府(补充图S1a和b)。
定义钻头扭矩的影响和坳气道炎症反应,我们测量白细胞招募BALF中细胞因子/趋化因子浓度肺匀浆。急性PAO1感染后6 h,老鼠TOB的对待航空或南卡罗来纳州。路线有更少的总细胞数(图2 e比vehicle-treated老鼠),表明减少炎症。虽然坳一般效果低于TOB细菌减少负担,它影响了招聘BALF的白细胞航空或南卡罗来纳州。管理局(图2 f)。嗜中性粒细胞计数下降后陀伯(图2 g)和坳(图2 h)治疗通过的航空和南卡罗来纳州。路线,但影响治疗通过的i.n。路线。巨噬细胞数量保持不变航空或i.n。政府,但增加后南卡罗来纳州。治疗与钻头扭矩和坳(补充图S2a, b)。
细胞因子/趋化因子资料显示,粒细胞集落刺激因子(g - csf)和角化细胞化学引诱物(KC)在治疗组小鼠的肺持续和显著降低钻头扭矩和坳航空和南卡罗来纳州。管理局(表1)。另外,巨噬细胞炎性protein-1β(MIP-1β)和肿瘤坏死factor-α(TNF-α)显著降低钻头扭矩和坳治疗,尽管规模较小。类似程度减少这些细胞因子/趋化因子与钻头扭矩和坳,尽管坳显示低功效比陀伯(cfu /肺),表明缺乏直接相关的细胞因子/趋化因子响应和细菌之间的负担。其他细胞因子/趋化因子的影响类型的抗生素和给药途径包括白介素(IL) 1α,IL - 6, IL-12p70,集落刺激因子(gm - csf)、单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) MIP-1α和咆哮。
功效受到长期的治疗计划和类型的抗生素铜绿假单胞菌肺部感染
模仿慢性感染类似通常建立于CF患者的肺,老鼠接受气管内的接种的铜绿假单胞菌MDR-RP73应变嵌入在琼脂珠(13]。政府通过的航空路线与16 mg·kg−1TOB或1毫克公斤−1坳(补充表S1)开始5分钟(“早期”治疗;图3(7天)或“晚”治疗;图4)感染后,重复每天七个政府(图1)。使用的剂量南卡罗来纳州。政府在160毫克公斤−1钻头扭矩和10 mg·公斤−1上校,基于剂量麦克风比率。
在过去的7天的“早期”治疗,TOB-treated老鼠表现出显著减少损失和更快的恢复比vehicle-treated老鼠的体重(图3一)。相比vehicle-treated老鼠时,老鼠TOB-treated显著减少细菌的负担,与大多数的老鼠清算后的感染航空或南卡罗来纳州。管理局(图3 c,补充表S2)。TOB治疗显著降低BALF中细胞计数,包括中性粒细胞,治疗车辆相比,表明减少炎症(图3 e,g)小鼠巨噬细胞数量减少到陀伯地去对待南卡罗来纳州。管理局(补充图S2a)。IL-1α,il - 6、IL-12p40 IL-17A MIP-1α,咆哮,TNF-α明显减少航空和南卡罗来纳州。管理路线(表2)。和KC - 2显著下降,而IL-9和IL-13只有增加航空TOB管理。MIP-1β显著降低,而IL-5只与增加南卡罗来纳州。TOB管理。因此,当接种感染后不久,TOB是有效减少细菌和炎症在肺部的负担航空和南卡罗来纳州。路线在慢性感染模型中。
在7天的“早期”治疗,COL-treated老鼠丢失和恢复体重相对vehicle-treated老鼠(图3 b)。治疗与车辆相比,治疗坳航空管理显著降低细菌负担(图3 d),而南卡罗来纳州。政府并不是有效的。道达尔和微分BALF中细胞计数显示减少的趋势,这对政府路线(没有统计学意义图3 f、h和补充图开通)。因此,只有少数细胞因子/趋化因子,包括IL-12p40 IL-17A, eotaxin, MIP-1α咆哮,坳治疗后明显下降通过的航空路线,而没有减少炎症介质南卡罗来纳州。管理局(表2)。因此,当接种感染后不久,卡扎菲是有效减少细菌的负担和一些细胞因子/趋化因子在肺部通过的航空路线,没有重大影响通过的南卡罗来纳州。给药途径在慢性感染模型中。
治疗感染后7天开始时(“迟”治疗),体重恢复TOB vehicle-treated老鼠(没有差异图4一)。TOB管理通过的航空或南卡罗来纳州。路线未能减少细菌负担(图4 c)或细胞因子/趋化因子水平(表3)。TOB管理通过的航空路线导致显著高于总细胞数(图4 e,g),主要由巨噬细胞(补充图S3a),相比vehicle-treated老鼠。TOB管理通过的南卡罗来纳州。路线并不影响炎症。
类似于“迟”TOB治疗的结果,体重的损失或恢复(图4 b),细菌负担(图4 d)和炎症细胞招聘(图4 f、h和补充图S3b)“末”坳没有差异,vehicle-treated老鼠。“末”之间细胞因子/趋化因子资料持平坳vehicle-treated老鼠,支持缺乏功效(表3)。我们的研究结果表明,治疗慢性感染模型中通过钻头扭矩和坳只有有效的抗生素管理时感染后不久。
讨论
抗菌功效受到政府的路线,类型的抗生素和感染模型
首先,我们使用了急性感染模型建立了直接的气管内的浮游管理参考应变PAO1评价抗菌药物的疗效TOB和坳由本地(航空或i.n。)或系统(南卡罗来纳州。)的路线。我们的结果表明,航空和南卡罗来纳州。政府TOB和坳显著降低细菌的负担。在急性感染模型中,功效显著降低钻头扭矩和坳i.n。管理,强调实现的难度甚至有效药物的功效与这条路。直接灌注物为当地提供治疗首选代理到啮齿动物的肺;然而,i.n。政府一直在报道导致药物在鼻腔(保留21]。这些观察是一致的与我们的PK数据和其他的研究,证明了低水平的坳后的肺i.n。政府(22]。相比之下,TOB迅速达到了航空公司,表明其明显高渗透i.n。管理。而使用传统的人适应nebuliser表明沉积效率低,因此,排除在这工作23),aerosoliser设备用于航空管理是一种非侵入性的气溶胶交付系统,确保了快速和良好的分子扩散进入航空公司(24]。这是支持的PK概要文件获得TOB和坳航空管理。细菌明显减少负担南卡罗来纳州。政府TOB和坳,尽管低观察肺渗透比TOB坳。关于细菌消灭,TOB治疗航空和南卡罗来纳州。政府清除铜绿假单胞菌在大多数的老鼠,而坳显著降低细菌负担,虽然实现了完整的间隙。总体而言,我们的数据并不完全支持任何直接联系功效(cfu /肺)和肺(PK)中的药物浓度,提高是否其他药物特性或宿主因素可能是重要原因。
接下来,我们使用一个慢性感染模型建立了直接的气管内的临床管理MDR-RP73应变嵌入在琼脂珠子。vehicle-treated动物相比,老鼠被本地(航空)或系统(南卡罗来纳州。)管理TOB感染后不久(“早期”治疗)表现出显著增加恢复和增加体重和减少细菌性肺部负担。相比之下,COL-treated老鼠没有表现出恢复和增加体重的差异相比,vehicle-treated老鼠。相比TOB治疗导致细菌间隙在大多数老鼠当管理通过的航空或南卡罗来纳州。路线,只有一个重要但适度减少细菌负担与坳治疗观察通过的航空路线,而南卡罗来纳州。上校管理并不是有效的。因此,“早期”TOB是有效的治疗急性和慢性感染模型,虽然坳的功效不同的两个小鼠模型。重复剂量毒性和潜在的不利影响可能部分解释获得的结果在慢性感染模型坳(25,26]。我们的研究表明,结果看到在短期治疗急性感染的小鼠模型可能无法预测的重复治疗方案的疗效在慢性感染。
我们的工作集中在免疫活性的C57BL / 6小鼠,没有观察到显著差异之间的细菌负担CF和non-CF老鼠前抗生素测试程序(17]。之前的数据显示,不影响治疗的疗效CF环境。相比之下,不同的菌株可以不同程度的疾病严重程度、潜在影响抗生素疗效。我们的动物实验进行选择铜绿假单胞菌菌株,PAO1急性感染和慢性感染MDR-RP73。这种限制有所减轻,这种选择背后的基本原理。PAO1参考应变具有毒性因素最相关院内肺炎等急性呼吸道感染(27,28]。在几个CF临床铜绿假单胞菌隔离测试,MDR-RP73是最有效的建立慢性肺炎小鼠模型(13,17,29日,30.),繁殖特征的CF和non-CF支气管扩张。
抗生素疗效影响慢性感染的治疗计划
建立慢性患者铜绿假单胞菌肺部感染,抗生素一般无法根除细菌病原体。因此,在先进的慢性感染,而不是根除治疗侧重于保护肺功能周期性发作的决议(31日]。治疗感染后7天开始时(“末”治疗)在慢性感染模型中,没有细菌减少负担或炎症,或观察体重恢复到b或上校的增长铜绿假单胞菌在生物膜,可以观察到在我们在先进的慢性肺部感染小鼠模型(14),可以解释抗生素无效,这种现象是治疗的一个重大的挑战铜绿假单胞菌。
细菌的炎症反应并不是严格反映变化的负担
本研究将感染的分析扩展到多个主机参数,包括测量BALF的免疫细胞和细胞因子/趋化因子生产的肺。尽管TOB的功效比上校在减少细菌负担在急性感染模型中,坳显著降低炎症的航空公司,尤其是中性粒细胞的负载,并适度程度大于钻头扭矩。这可能反映了免疫调节效应的贡献的抗生素疗效[32,33与额外的模型系统,值得进一步调查。评价细胞因子/趋化因子资料显示显著降低水平的g - csf和KC小鼠接受TOB和坳由当地和系统性管理。我们知道这两种免疫介质嗜中性粒细胞生产的决定因素,分化和招聘。他们的减少是独立于抗生素给药途径,表明g - csf和KC强有力的候选药效生物标记。其他细胞因子/趋化因子也影响类型的抗生素和给药途径。应该指出,这些差异在主机响应没有严格调制与细菌的程度的负担。
在慢性肺部感染,在治疗开始后不久感染(“早期”治疗),TOB高效减毒炎性反应,尤其是中性粒细胞,更大程度上比急性感染模型。浓度不同的细胞因子/趋化因子,如IL-17A和il - 6,显著降低了本地和系统性管理到陀伯地去,表明宿主反应的复杂的场景。调制的其他细胞因子/趋化因子依赖于政府的路线。例如,KC是由当地治疗显著降低,MIP-1β全身治疗。的“早期”治疗坳,炎症反应的细胞招募BALF中没有明显影响,且仅一个重要但适度减少一些细胞因子/趋化因子检测只后当地政府。
在感染后治疗起步较晚时(“末”治疗)在慢性感染模型中,无论是TOB还是坳可以减少细菌的负担或调节免疫反应。值得注意的是,整个小组的细胞因子/趋化因子仍抗生素的影响,这个结果代表了一个重要的问题治疗晚期慢性铜绿假单胞菌感染。
结论
这项工作对动物模型的必要性,协议和结束点改善药物测试的预测价值和临床相关性,按照欧洲呼吸学会工作组的建议(188bet官网地址34]。到目前为止,临床前动物模型不满意地预测人类呼吸道疾病的复杂性,危及药物功效测试的成功。这在呼吸道感染,获得特殊的意义铜绿假单胞菌病原体,特别是难以治疗,因为其惊人的适应能力。我们的结果在一个临床前平台强调仔细选择合适的小鼠模型的重要性和疾病的治疗方案在调查中优化抗生素测试(图5)。通过分析细菌和宿主反应,我们定义多个端点关键参数来验证反的功效铜绿假单胞菌治疗方法。我们发现这些程序在特定疾病模型的组合可能会提供一个增强的临床试验和临床试验之间的联系。未来的挑战是改善这些小鼠模型,包括额外的变量如宿主遗传背景,polymicrobial社区和随之而来的使用其他治疗方法35- - - - - -37进一步反映了人类疾病的复杂性。
补充材料
可共享的PDF
确认
作者要感谢b .说话(汉诺威医学院,汉诺威,德国)提供铜绿假单胞菌应变的CF患者。我们感谢Chiara Bigogno乌拉Bastrup和朱里奥Dondio PK研究由APhaD(米兰,意大利)。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
作者的贡献:构思和设计实验:c . Cigana和Bragonzi。执行实验:c . Cigana Ranucci, a·罗西德o和m . Melessike。分析数据:c . Cigana Ranucci和罗西。造成试剂/材料/分析工具:a . Bragonzi。写作:c . Cigana和Bragonzi。
利益冲突:美国Ranucci没有披露。
利益冲突:a .罗西没有披露。
利益冲突:即非诺没有披露。
利益冲突:m . Melessike没有披露。
利益冲突:a . Bragonzi没有披露。
利益冲突:c . Cigana没有披露。
支持声明:a . Bragonzi研究实验室是由意大利囊性纤维化基金会(CFaCore)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
- 收到了2018年12月28日。
- 接受2019年10月10日。
- 版权©2020人队
这个版本分布在创作共用署名非商业性许可证的条款4.0。