长期的影响在慢性阻塞性肺病的microRNA基因和皮质类固醇治疗
- 阿伦的费1,2,3,4⇑,
- 卡特里娜斯泰尔5,
- Mirjam p Roffel2,3,
- Dirkje s Postma1,3,
- Avrum斯派拉5,
- 马克·e·Lenburg5,
- 马尔特Borggrewe2,
- 蒂姆·r·Eijgenraam2,
- Marnix r·彼特2,
- 杰拉德·h·Koppelman3,6,
- 西蒙·d·Pouwels1,2,3,
- 刘帮5,
- 看门人尤里o . Alekseyev7,
- 斯蒂芬•林8,
- Pieter s Hiemstra9,
- 彼得·j·斯德克已10,
- 维姆·华2,3,
- Corry-Anke Brandsma2,3,
- 艾琳·h·Heijink1,2,3,11和
- Maarten van den贝1,3,11
- 1格罗宁根大学、格罗宁根大学医学中心部门的肺部疾病,格罗宁根,荷兰
- 2格罗宁根大学、格罗宁根大学医学中心部门的病理生物学和医学,格罗宁根,荷兰
- 3格罗宁根大学、格罗宁根大学医学中心GRIAC(格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所),荷兰格罗宁根
- 4悉尼科技大学理学院,呼吸生物信息学和分子生物学(RBMB),上月的,澳大利亚
- 5波士顿大学医学院的计算生物医学,医学部门,波士顿,MA,美国
- 6格罗宁根大学、格罗宁根大学医学中心部门的小儿肺学儿科变态反应学,比阿特丽克斯儿童医院,格罗宁根、荷兰
- 7波士顿大学医学院的病理学和实验室医学部门,波士顿,MA,美国
- 8癌症成像,不列颠哥伦比亚癌症研究中心,温哥华BC,加拿大
- 9莱顿大学医学中心、部门的肺疾病、莱顿、荷兰
- 10阿姆斯特丹大学呼吸医学部门,f5 - 259,学术医疗中心,阿姆斯特丹,荷兰
- 11两位作者的贡献同样
- 阿伦的费、建筑4、房间04.07.418悉尼科技大学的托马斯•圣上月的、新南威尔士、澳大利亚。电子邮件:a.faiz在{}umcg.nl
文摘
目的是调查是否microRNA microRNA的表达是由吸入激素(ICS)调制治疗
69年我们进行全基因组microrna分析支气管活检中度/重度慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者在基线和6 - 30个月后与ICS丙酸或安慰剂治疗。ICS microrna的表达是验证的效果在支气管上皮分化主要文化中,在BEAS-2B细胞和功能进行了研究。microrna ICS的影响和预测目标相比,一个独立的microrna的数据集的支气管刷COPD患者和健康对照组。
ICS治疗6和30个月显著改变四个microrna的表达,包括mir - 320 d,这期间增加ICS治疗与安慰剂比较。ICS-induced增加mir - 320 d的确诊主要气道上皮细胞。mir - 320 d负相关目标丰富的炎性基因和增加支气管刷低肺功能患者的独立的数据集。超表达BEAS-2B mir - 320 d的细胞抑制香烟extract-induced炎性活动通过抑制核factor-κB。
集体,我们发现mir - 320 d的小说中介ICS,调节气道上皮细胞的炎性反应。
文摘
mir - 320 d是一种新型的中介的吸入型皮质类固醇激素,调节气道上皮细胞的炎性反应http://ow.ly/r4IV30nCQeE
介绍
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是慢性、不完全可逆的气流限制通常是进步与炎症反应和相关航空公司(1]。吸入有毒气体,包括吸烟,慢性阻塞性肺病的主要危险因素。一些研究调查的功效吸入激素(ICS)在慢性阻塞性肺病2- - - - - -4),与冲突的结果(2- - - - - -4]。只有一个亚组病人反应ICS。鉴于这种异构性,相关性进行研究在慢性阻塞性肺病治疗的反应。格罗宁根,莱顿大学研究糖皮质激素的阻塞性肺疾病(GLUCOLD),双盲,随机,安慰剂对照研究探讨丙酸的长期疗效有或没有添加氟替卡松加沙美特罗在慢性阻塞性肺病,发现了一个更大的改善肺功能下降在ICS治疗比大多数早期的研究(5]。这可能是由于不同的入选标准,要求病人没有ICS治疗≥6个月之前,包括在这项研究中,95%的患者从未使用ICS。在GLUCOLD,接受安慰剂的患者经历了一个相当大的下降在1 s (FEV用力呼气量1),而FEV的速率1下降了接近于零的丙酸和丙酸氟替卡松加沙美特罗处理5]。这些结果表明,ICS可以是有益的,至少在慢性阻塞性肺病患者的一组中。在后续研究中,我们进行了全基因组基因表达分析从GLUCOLD支气管活检患者基线,和6和30个月的治疗后6),这使我们能够区分ICS-sensitive和不敏感的病人根据他们的基因表达。然而,控制ICS-induced的基因表达变化的机制仍然未知,和理解这个过程可能导致新型抗炎通路的识别。
小分子核糖核酸(microrna) s是小非编码RNA信使(m)记录的能力降低或抑制mRNA转录,导致抑制蛋白质的水平。因为每个microrna的可以调节> 100个基因的表达(7),microrna的水平可以从根本上改变基因的变化。在目前的研究中,我们假设,microrna是至关重要的在调节ICS-induced基因表达在慢性阻塞性肺病患者的航空公司。研究这个问题,我们评估改变microrna的表达与ICS短期和长期治疗后,我们可以发现他们的目标基因,因为microrna和mRNA数据可以从相同的支气管活检。我们确认的功能角色识别microrna在体外在人类支气管上皮细胞。我们的研究发现mir - 320 d,作为新型抗炎microrna的糖皮质激素调节的。
方法
病人和研究设计
microrna的表达谱进行支气管活检在慢性阻塞性肺病患者参与GLUCOLD研究[5]。入选标准和GLUCOLD研究设计前面描述的(5]。简单,患者需要没有ICS治疗≥6个月之前包容、当前或抽过烟了中度到重度慢性阻塞性肺病。患者纳入本研究1)每天两次安慰剂治疗,疗程30个月;2)丙酸500µg为30个月每天两次;或3)丙酸500µg +氟替卡松加沙美特罗50µg连续30个月(每天两次表1)。支气管活检被在基线和6和30个月后治疗微阵列基因表达分析和组织学。这项研究是经当地医学伦理委员会批准,所有病人提供他们的书面知情同意。microrna的隔离方法,标签,微阵列杂交(GeneChip microrna 1.0数组;美国圣克拉拉,Affymetrix CA)中所描述的补充材料,信使rna提取方法和微阵列处理前面描述的(6]。基因和miRNA-expression数据可通过基因表达综合库(www.ncbi.nlm.nih.gov /地理/)加入数字GSE36221 GSE76774,分别。在一个独立的群体,microrna的表达分析获得了来自支气管刷30慢性阻塞性肺病(由FEV定义的170年和FEV /用力肺活量<1< 80%)和30 non-COPD控制使用Illumina公司HiSeq(美国圣地亚哥,CA)。
统计数据
识别microrna改变ICS治疗,我们进行线性混合效应模型与治疗类别变量有两个层次:ICS或ICS +长效β2受体激动剂(腊八粥)(运行两个独立的分析)与安慰剂(R统计软件,V3.0.2;www.r-project.org)。时间被定义为一个分类变量有三个级别:基线,6 - 30个月治疗。这些方法在广泛详细的解释补充材料。
预测目标的方法
识别不同的microrna表达的潜在目标,treatment-induced microrna的表达变化比较mRNA表达的改变在同一切片(6]。皮尔逊相关性在1)基线和2)microrna的变化和mRNA表达后6个月专注于预测mRNA为每个microrna的目标(基于目标的组合扫描v7.1 [7)和DIANAmicroT)。microrna的负相关目标与分析是负相关(p < 0.05)被选为通路分析使用基因集富集分析(GSEA)和GeneNetwork [6]。
这种分析后,负相关改变的预测目标ICS研究从63吸烟者支气管刷与慢性阻塞性肺病和135控制吸烟者没有使用ICS的历史或口服糖皮质激素在一个独立队列使用连续COPD-related FEV的测量1。GeneNetwork分析调查的预测目标识别microrna(名义p值< 0.05)[8]。
GeneNetwork分析使用一个独立的基因表达数据集78∼000个样本来预测基因的功能在一个公正的方式。我们使用这个方法来预测未知(目前)基因功能基于已知的生物通路分子特征数据库中可用MSigDB(生物过程和reactome) (www.broadinstitute.org)[8]。
主支气管上皮细胞培养
主支气管上皮细胞(PBECs)从气管支气管的9个健康的肺组织捐助者通过链霉蛋白酶治疗如前所述[9]。细胞培养(如前所述9和详细补充材料。microrna的表达进行实时PCR的详细描述补充材料。
香烟烟雾提取物的制备
香烟烟雾提取物(CSE)是如前所述和准备的补充材料(9]。浓度的CSE用于每一个细胞系均由一系列浓度的0 - 50% CSE然后膜联蛋白V propidium碘(π)染色10]。每个细胞株的浓度选择减少细胞死亡而控制。CSE BEAS-2B 10%被选中而PBECs 20%选择CSE (补充图S1A和B)。
mir - 320 d BEAS-2B细胞和PBECs超表达
人类支气管上皮细胞系BEAS-2B和PBECs培养如前所述[11]。转染的细胞被播种在重复RPMI / 5%胎牛血清或支气管上皮细胞生长介质在1×105板材在24-well BEAS-2B PBEC,分别。在24小时之后,细胞转染和mir - 320 d模拟(1纳米;试剂盒,Venlo、荷兰)和不属预定目标的控制(1纳米;试剂盒)使用RNAimax(表达载体,格罗宁根、荷兰),发展到融合,serum-deprived 24 h和对待BEAS-2B (10% CSE 24小时的存在和缺乏丙酸(10−8米)预处理对3 h),而PBECs处理20% CSE 8到24 h。膜联蛋白V PI染色用于确认没有额外的转染的细胞死亡发生炒和mir - 320 d模拟(补充图就是S1C)。高剂量的CSE PBECs被选中,当我们发现之前的主要细胞不敏感CSE比细胞系(12]。收集细胞溶解产物和浮在表面的游离确定mir - 320 d表达和CXCL8水平在24小时的时间点(研发系统,阿宾顿,英国),在mRNA收集8 h刺激PBECs并提取测量白介素(IL) 1β和CXCL8 mRNA水平使用定量PCR (13]。
基因表达分析在公开的数据集
调查基因导致增加CXCL8在烟雾暴露我们分析了公开数据集(GSE30660)的气液界面(ALI)分化PBECs (n = 4)从健康的捐赠者有/没有重复烟挑战(30分钟暴露在四个不同的日子)。我们专注于基因增加了香烟烟雾(褶皱变化> 2,错误发现率(罗斯福)< 0.05)使用R版本3.1.4和limma包。
核factor-κB活动
调查是否过度mir - 320 d直接抑制核转录因子(NF) -κB活动,我们使用renilla测定荧光素酶记者根据制造商的指示(Promega、莱顿、荷兰)中所描述的补充材料。
结果
microrna的表达和mRNA表达的变化之间的联系
我们下一个检查是否ICS的microrna改变消极的规范表达自己的预测目标COPD-derived支气管活检。我们进行了横断面分析基线和6个月和基线之间的纵向分析。所有四个microrna确定至少有一个重要negative-correlated预测目标在横向或纵向分析,这些分析重叠与每个microrna的范围在30.9%和80.7%之间(补充图S2A-D)。补充表S1提出了关联。连接网络分析确定两个主要集群microrna及其预测的目标:1)mir - 708和mir - 155,这是减少了ICS治疗;2)mir - 320 d和mir - 339 - 3 - p,这增加了ICS治疗(图1 d)。
复制ICS的microrna的改变
对于确定microrna的进一步验证,我们调查了第三GLUCOLD队列的手臂,即。患者ICS +腊八。候选人的方法确定的四个microrna, mir - 320 d, mir - 339 - 3 - p和mir - 708也显著改变在同一方向通过ICS +腊八相比安慰剂在6个月治疗(p < 0.05)。ICS和ICS +腊八之间的比较分析中说明了补充图S3接下来,我们调查的独立数据集是否mir - 320 d, mir - 339 - 3 - p和mir - 708之间改变慢性阻塞性肺病患者使用ICS (n = 6)相比,慢性阻塞性肺病患者不是ICS (n = 24)。复制,我们另外关注mir - 320家庭,mir - 320 - a - d都有非常相似的序列和有相同的预测目标(补充图S4A)。这里我们发现mir - 320家族(mir - 320 a, mir - 320 b - 1, mir - 320 b - 2和mir - 320 - c - 2)被ICS显著增加,而mir - 320 - c - 1和mir - 320 d被发现有一个趋势增加(分别为p = 0.057, p = 0.086)反映出初步结果分析(补充图S4B-G和补充表S2)。mir - 339 - 3 - p和mir - 708并没有发现显著改变ICS在同一个方向。
通路分析microrna的目标
使用GeneNetworks,我们发现mir - 320 d负相关预测目标相关的炎性相关通路包括肿瘤坏死因子(TNF) -α信号和细胞因子的生产,而mir - 339 - 3 - p预测目标是与监管相关的离子传输(名义p值< 0.05)。最后,mir - 708负相关预测目标被发现与调节离子运输和激活磷脂酶C活动(名义p值< 0.05)。每个microrna的五大路径的列表中显示表3;一个扩展的列表中提供补充材料(补充表S4)。评估是否microrna的负相关预测目标是ICS敏感,我们执行GSEA GLUCOLD数据之前和之后的6个月ICS治疗与安慰剂相比。正如预期的那样,大多数的microrna的负相关预测目标改变了ICS针对microrna的相反的方向,mir - 708负相关的目标是增加,mir - 339 - 3 - p和mir - 320 d负相关的目标是减少了ICS (图2一个和补充图S5)。
治疗相关的microrna的表达变化与慢性阻塞性肺病或气流阻塞的严重程度在一个独立的群体
确定microrna受到ICS治疗是临床相关的影响,我们研究了协会的microrna的表达与慢性阻塞性肺病和FEV的水平1% pred支气管刷的一个独立的群体,microrna的表达谱在哪里可以从30吸烟者和30没有慢性阻塞性肺病(14]。的三个microrna ICS治疗后改变,mir - 708被发现之间的相反的方向改变了慢性阻塞性肺病和控制,高表达COPD-derived支气管刷(p < 0.05)。没有发现差异mir - 320 d或mir - 339 - 3 - p。
接下来,调查是否负相关microrna的预测目标相关疾病发病机理,我们进行了GSEA扩大人口从相同的独立与全基因组基因表达数据队列可用63年支气管刷现任或前任吸烟者和135没有慢性阻塞性肺病14]。与microrna的分析,这是进行连续COPD-related FEV1测量。mir - 320 d之间的负相关预测目标丰富的基因增加肺功能较低,而mir - 708之间的负相关预测目标丰富的基因减少科目较低肺功能(图2 b和补充图S6)。没有这样的协会发现mir - 339 - 3 - p预测目标。
mir - 320 d是调节皮质类固醇治疗在体外
接下来,我们检查是否ICS直接规范所确定的microrna的表达在ALI-differentiated PBECs从健康的捐赠者。治疗卡松丙酸(10 nM) 24 h导致重大upregulation mir - 320 d,而mir - 708表达趋势减少mir - 339并没有改变(图2 c和d)。
mir - 320 d作为抗炎microrna通过调节IL-1β-induced NF-κB信号
mir - 320 d是将目标基因与细胞因子相关生产,我们提出,mir - 320 d调节促炎细胞因子/趋化因子的表达如CXCL8、慢性阻塞性肺病的主要促炎细胞因子增加。研究这个问题,我们中mir - 320 d在人类支气管上皮细胞系BEAS-2B和PBECs (图3一)和评估CXCL8释放对CSE 10%和20%。mir - 320 d的超表达显著降低CSE-induced CXCL8释放在BEAS-2B和PBECs (图3 b和c)。此外,过度的mir - 320 d CXCL8 mRNA水平降低烟雾暴露在PBECs期间,支持蛋白质数据(补充图S7A)。顺便说一句,我们发现吸烟最小影响CXCL8 mRNA水平6 h。CXCL8不是mir - 320 d的预测目标基因,因此其他上游介质可能是参与。调查mir - 320 d如何影响香烟烟雾诱发炎性上皮反应,我们使用一个公开的数据集ALI-cultured PBECs源自健康对照组暴露或没有接触到气体烟(GSE30660)。62个基因被香烟增加治疗(褶皱变化> 2,罗斯福< 0.05)。字符串网络分析发现,这些62个基因有一个浓缩的蛋白质-蛋白质之间的关系与此列表与慢性炎症(图S7B S4补充表,补充)。IL-1β被认定为中心感兴趣的基因在这个网络(补充图S7C和D);IL-1β之前是一个细胞因子确定为一个关键炎症慢性阻塞性肺病的积极监管机构增加了香烟烟雾暴露(15]。我们以前观察到CSE上调il - 1 mRNA表达PBECs [16]。此外,我们发现mir - 320 d的超表达基线显著降低IL-1βmRNA水平(补充图S7E)。这些结果表明,CSE诱发CXCL8生产通过激活IL-1β通路。
基于这些发现,我们评估是否mir - 320 d可以减弱IL-1β-induced CXCL8生产通过著名下游中介抑制NF-κB IL-1β促炎作用。为此,BEAS-2B细胞转染与记者NF-κB构造和处理IL-1β24小时的存在和缺乏mir - 320 d超表达。IL-1β治疗显著激活NF-κB信号,发现mir - 320 d超表达显著减少NF-κB IL-1β-induced激活的信号相比,负microrna的控制(图3 d)。mir - 320 d的提议机制中提供图3 e。
讨论
在目前的研究中,我们确定了四种microrna影响短期和长期的ICS治疗与安慰剂相比在中度到重度慢性阻塞性肺病患者。此外,我们表明,这些microrna的预测目标被ICS治疗和改变,特别是mir - 320 d之间的目标是丰富基因与肺功能下降有关。在体外,我们证实了ICS的直接影响mir - 320 d表达在支气管上皮和发现mir - 320 d超表达减少CSE-induced CXCL8释放。这个抗炎功能被发现部分介导的抑制IL-1β/ NF-κB通路。
我们进一步观察到负相关预测mir - 320 d的目标是减少了ICS治疗。尽管microrna测定支气管刷在一个独立队列显示没有明显的减少与慢性阻塞性肺病mir - 320 d, mir - 320 d预测目标基因与COPD组增加。后者可能表明mir - 320 d调节基因表达可能在慢性阻塞性肺病被打扰
我们第一次发现mir - 320 d的抗炎作用。这是由我们的路径分析,发现mir - 320 d是一种消极监管机构与炎性通路相关的基因,包括TNF-α信号和细胞因子的生产。mir - 320 d抗炎作用进行验证在体外在气道上皮细胞,因为我们发现mir - 320 d超表达抑制CSE-induced CXCL8通过抑制NF-κB激活。在这里,IL-1β刺激被证实是一个强有力的NF-κB活动的诱导物。我们的数据与先前的研究表明,气道上皮细胞释放IL-1β针对香烟治疗(17,18]。与NF-κB通路相关的基因在分化调节PBECs对待香烟,并增加NF-κB活动一直在观察慢性阻塞性肺病(19,20.]。CXCL8是中性粒细胞浸润到气道的关键中介组织作为中性粒细胞化学引诱物(21]。
香烟烟雾中提供的一个主要炎症发起者在慢性阻塞性肺病22,23];然而,负责异常炎症反应的机制在吸烟与慢性阻塞性肺病和为什么不能有效地抑制由ICS在所有的病人仍不确定。我们的研究结果支持假设mir - 320 d调节香烟烟雾诱发CXCL8通过抑制NF-κB信号,并可能因此参与ICS的抗炎效果。
此外,mir - 155调节炎症反应可能是潜在的兴趣,这是我们最初的识别分析,以往的经验显示与小鼠哮喘模型的气道炎症相关(24]。然而,我们没有进一步调查mir - 155在第二个差别我们不能复制它对这些基因的分析。
与我们的研究结果相比,前一个横断面研究无法找到支气管活检的microrna的表达谱差异和没有ICS治疗在哮喘患者25]。我们相信研究之间的差异可能是由于纵向性质,严格的选择标准和当前研究的更高的力量,或可能的内在区别哮喘和慢性阻塞性肺病患者。
本研究的主要优势之一是全球microrna的co-analysis和基因表达变化随着时间的推移,因此让我们相关基因表达的变化与纵向microrna的表达变化的预测microrna的目标。这种实验装置克服了未知的一个主要假设的横断面研究匹配microrna的信使rna样本,即microrna和基因表达之间的关系随着时间的推移保持一致(26,27]。验证我们的发现的在活的有机体内慢性阻塞性肺病的小鼠模型可以提供进一步洞察mir - 320 d的抗炎作用[28]。
对我们的研究有一定的局限性。尽管样本被临时冻结在收集后−80°C, RNA降解中发现了一些样品,反映在相对较低的RNA完整性(RIN)数量的分数。因此,我们调整了RIN得分值在所有在本研究进行的分析。支气管活检包含细胞群的混合物。重要的是,调整后的炎性细胞计数,mir - 320 d, mir - 339 - 3 - p和mir - 708仍然显著,表明microrna的表达的改变并不是由于ICS-induced炎性细胞数量的变化。最后,正如我们使用microrna的阵列我们可能错过了一些新颖的microrna。
总之,我们有异形全球microrna的表达从中度到重度COPD患者支气管活检,后纵向ICS治疗与安慰剂相比在基线,6和30个月。我们发现四个microrna (mir - 320 d, mir - 339 - 3 - p, mir - 708和mir - 155)后被改变ICS治疗。此外,我们发现mir - 320 d作为新型抗炎microrna的抑制NF-κB活动在体外。microrna与ICS治疗和炎症相关的尽可能的为未来的研究提供重要的候选人在慢性炎性疾病生物标志物和治疗目标。
补充材料
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
作者的贡献:a .费兹进行了微阵列分析在体外细胞工作,项目设计和写作的手稿。议员Pouwels,时任Roffel,顶替Eijgenraam和m . Borggrewe辅助在体外细胞的工作。科学博士Postma, I.H. Heijink, a Spira G.H. Koppelman参与项目设计和起草的手稿。I.H. Heijink监督实际工作。美国林non-COPD和慢性阻塞性肺病支气管刷的集合。k·斯泰尔进行分析比较non-COPD microRNA表达和慢性阻塞性肺病和写作的手稿。m . van den Berge进行微阵列分析,工程设计和写作的手稿。核磁共振Jonker促成了在体外细胞的工作。注:Hiemstra P.J.斯德克已和w·华参加了修订手稿。c - a。Brandsma执行路径分析。刘和Y.O. Alekseyev加工mRNA和microrna的微阵列分析样品。所有作者阅读和批判性回顾了手稿。
利益冲突:a .费没有披露。
利益冲突:k·斯泰尔专利“COPD疾病的生物标志物活动”等待。
利益冲突:议员Roffel没有披露。
利益冲突:科学博士Postma报告机构拨款从阿斯利康,基耶西,Genentec,葛兰素史克和罗氏公司,和费用咨询公司从阿斯特拉捷利康,勃林格殷格翰的发言,基耶西,葛兰素史克,武田和梯瓦。
利益冲突:a . Spira没有披露。
利益冲突:主机Lenburg没有披露。
利益冲突:m . Borggrewe没有披露。
利益冲突:西奥多Eijgenraam没有披露。
利益冲突:核磁共振Jonker没有披露。
利益冲突:G.H. Koppelman报告制度从荷兰肺脏基金会赠款,Ubbo Emmius基金会,梯瓦制药和左Astma Bestrijding,外提交的工作
美国南达科他州的利益冲突:Pouwels没有披露。
利益冲突:g .刘没有披露。
利益冲突:Y.O. Alekseyev没有披露。
利益冲突:美国林没有披露。
利益冲突:另外Hiemstra赠款从荷兰科学研究组织报道,荷兰哮喘基金会,格罗宁根大学、莱顿大学医学中心和葛兰素史克公司,在进行这项研究的。
利益冲突:P.J.斯德克已报告从葛兰素史克和荷兰政府赠款,在进行这项研究的。
利益冲突:w·华报告辉瑞和默克的个人费用咨询Dohme,个人费用从葛兰素史克讲课,莉莉肿瘤学和基耶西,个人费用说教,从罗氏诊断/ Ventana咨询和旅游,旅行费用从生物监测,个人费用说教和咨询公司诺华,从荷兰哮喘和赠款基金,在提交工作。
利益冲突:c - a。Brandsma没有披露。
利益冲突:I.H. Heijink没有披露。
利益冲突:m . van den Berge报告机构研究经费从基耶西梯瓦制药公司,阿斯利康在提交工作。
支持声明:这项工作得到了Longfonds,荷兰、初级研究员格兰特(4.2.16.132JO数量;A.Faiz)和欧洲呼吸188bet官网地址学会RESPIRE2奖学金。
- 收到了2018年1月24日。
- 接受2019年1月30日。
- 版权©2019人队