冠状病毒对人鼻铅呼吸上皮的影响
- C. O'Callaghan,莱斯特大学儿童健康系儿童哮喘中心,莱斯特皇家医院罗伯特基尔帕特里克临床科学大楼,6694,邮政信箱65,莱斯特,LE2 7LX,英国。传真:44 1162523282
摘要
人类冠状病毒(HCOV)占普通感冒的15-30%,但只有一个病例报告描述了冠状病毒感染的效果,即人类呼吸上皮的渐近性。
作者检测了HCOV对HCOV对睫状体结构的影响,并用HCOV 229e感染的健康志愿者的功能。另外四名志愿者被紫外线灭活病毒感染了假。在接种前(第0天)和3天(第3天)之前,通过刷涂下鼻鼻甲获得纤毛的上皮。确定睫状振频频率并使用数字高速视频摄影分析禁止障碍症的证据(0 =正常,3 =严重停滞不短)的击败模式。通过透射电子显微镜检查睫状体超微结构。症状日记持续到研究期间。
所有接种HCOV的受试者,包括三个没有产生上呼吸道感染的症状的三个受试者在第3天发生了呼吸上皮的破坏。虽然第0天之间的平均睫状拍频率没有差异(11.3 Hz(95%置信区间(CI):8.6-14.0)和第3天(9.4Hz(95%CI 7.2-11.6)),在0天之间的睫状体止吐瘤评分中显着增加(p <0.05)(0.2(95%(95%)CI 0-0.5)和第3天(1.1(95%CI 0.5-1.7)。在假感染的受试者中,在第0天和第3天之间没有发现上皮完整性或睫状体结构和功能的差异。
健康志愿者接种人冠状病毒引起纤毛上皮破坏和纤毛运动障碍。这可能损害粘液纤毛清除。由于人冠状病毒感染而造成的呼吸道上皮损伤可能没有明显的临床症状。
- 纤毛
- 睫毛击败频率
- 新冠病毒
- 呼吸上皮
- 超微结构
- 病毒感染
这项工作得到了囊性纤维化的信托,梅索医疗基金会和国家哮喘活动。
“普通感冒”是一种普遍认可的短暂疾病,其中主要症状涉及上呼吸道,其中鼻症状通常占主导地位。理解病毒和上皮之间的相互作用是确定产生症状的机制的重要一步。对呼吸上皮的结构损伤1-3.纤毛功能异常1那4.那5.在病毒感染期间可能破坏粘液纤毛扶梯4.那6.,有助于鼻排放和障碍的症状。虽然一些受感染的志愿者患有鼻塞和放电,但相同数量的感染受试者没有明确的症状。这仍然不清楚这一点7..
人冠状病毒(HCOV)是普通感冒的第二个最普遍的原因。他们占熟悉病毒感染的15-30%8.并可能导致抑制症状的呼吸系统疾病如哮喘9..关于呼吸上皮的HCOV感染效果的数据令人惊讶地稀疏。识别HCOV的初始方法体外气管器官培养,其中不易发现感染。从上皮表面反射的光线的显微镜被用作纤毛活动的指标,而光线反射的丧失被作为病毒感染的结果测量10..其他数据包括在为睫状体肽的2岁女性中,HCOV感染的电子显微镜对电子显微镜感染的偶然发现。令人兴趣的是,这种感染无症状无症状,在活组织检查或之后,没有常见感冒的迹象11..
在本研究中,HCOV 229E(美国型文化收集,Rockville,MD,USA),冠状病毒的两种主要血清型核算中上呼吸道感染12.,被用来接种健康的志愿者。目的是确定HCOV感染对鼻性上皮超微结构和鼻纤硅的超微结构的影响。
方法
主题
15名成年志愿者(11名男性,4名女性)没有鼻部或呼吸道疾病。年龄18-35岁(中位22岁)。所有受试者均未服用鼻腔药物,且在前6周内均无上呼吸道感染症状。这项研究得到了莱斯特郡伦理审查委员会的批准。
人类冠状病毒接种
根据人胚胎肺成纤维细胞的良好实验室实践标准培养HCOV 229E(美国型文化收集)。如前所述制备接种物13.并根据Gwaltney的标准进行安全测试等等。14..接种物由1ml HcoV 229E悬浮液的等分试样(200%50%组织培养剂量(TCID50)每毫升),在−70°C保存。如前所述,11名受试者(9名男性和2名女性)接种了活性病毒7..简而言之,随着志愿者的头部延伸到45°,将0.5毫升病毒灌输到每个鼻孔中。
除病毒抗原之外,接种物还可含有从受感染的培养细胞(如细胞因子)释放的其他小蛋白质。这些蛋白质可能干扰感染过程或甚至产生炎症反应。为了控制这一点,通过如前所述的紫外(UV)光灭活的病毒接种了四种受试者15..用接种了活性病毒的对照瓶培养人胚胎肺成纤维细胞,证实了灭活。有活性病毒的细胞在第10天出现了完全的细胞病变,而紫外线灭活病毒的细胞在终止培养后第18天没有出现细胞病变。
感冒评估
症状日记基于杰克逊使用的日记等等。16.记录上呼吸道症状(鼻窦,鼻堵塞和打喷嚏)和全身症状(头痛,不适和寒冷)。根据严重程度,每种症状得分于0-3点。杰克逊的标准等等。16.然后用之前验证过的方法进行修改17.根据上呼吸道评分将志愿者分为以下几组:绝对感冒(在接种后2 - 6天内,至少连续两天的感冒评分≥2分,高于零基线);可能感冒(在2 - 6天内,至少连续2天,在零基线上轻微增加或评分高于症状基线≥2分);没有感冒(没有症状)。
实验室确认感染是通过从接种后第3天的鼻腔灌洗液中提取的病毒核糖核酸(RNA)的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。这遵循了先前建立的方法13..
睫状体结构和功能评估
在病毒接种和接种后3天,通过用2mm细胞学刷(BC-15C,South-On-Sea,UK)刷新下鼻鼻甲获得纤毛化样品。18..已发现这是纤毛上皮反复采样的理想场所3..选择第3天,因为以前关于病毒感染的研究发现,前2天几乎没有影响,第4天呼吸上皮发生了非常显著的变化2.鼻腔胶凝剂置于培养基199(25mM羟乙基哌嗪乙烷磺酸,含有抗生素溶液的吲哚盐,L-谷氨酰胺(pH 7.3))(链霉素50μg·ml-1青霉素50µg·mL-1, GibcoBR生命技术公司,佩斯利,英国)。
透射电子显微镜
通过鼻泌刷涂获得的组织在Sorensons磷酸盐缓冲液中固定在2.5%谷氨酸中48小时,然后固定在1%锇氧化锇中。在蒸馏水中漂洗后,将细胞嵌入45℃下在2%液体琼脂中嵌入,并允许固化。将其通过标准技术加工成树脂。将超薄部分切割为70nm。这些被收集在200目薄棒状铜网上,并染成1%乙酸铀酰染色并在Reynolds铅磷酸盐中染色。然后通过透射电子显微镜检查部分。
以盲目的方式评估纤毛的上皮,用于上皮和睫状体超微结构的变化。首先通过评估细胞类型来评估上皮完整性。纤毛细胞,粘液细胞和死细胞的数量表示为检查所有细胞的百分比。其次,使用曾荫描述的评分系统量化组织的破坏和损伤等等。19..简单地说,对组织进行如下评分:纤毛细胞的纤毛减少:0(完全纤毛),1,2,3(3=很少可见纤毛);细胞从上皮边缘投影:0(正常排列)、1、2、3(3=细胞从边缘投影但与其他上皮细胞有一定接触);胞浆起泡:0(无),1(次要),2(主要);线粒体损伤:0(无),1(存在)19..
通过检查微管和Dynein臂缺陷的睫状体超微结构来评估对单个纤毛的损伤。通过测量睫状体取向来确定细胞内单个纤毛的对准20..
计算含有纤毛,细胞投影,细胞质膨胀和线粒体损伤的细胞数量的百分比。类似地,计算具有微管或Dynein臂缺陷的细胞的百分比。
睫毛击败频率和节拍模式
由两个相邻的盖片将盖片和玻片分离而形成的腔室中悬浮上皮纤毛条。载玻片被放置在一个装有Leitz, Diaplan显微镜的加热台上(37°C),该显微镜安装在防振台上(Wentworth Laboratories Ltd, Sandy, Bedfordshire, UK)。使用×100干涉对比透镜检查标本。只研究了长度为>50µm的未断裂纤毛条。
使用数字高速摄像机(Kodak Motioncorder 1000, Kodak, San Diego, CA, USA)以400帧·s的速率记录纤毛边缘的跳动-1,使用如前所述的4,000英寸的快门速度21..简而言之,相机允许通过帧以减少的帧速率或帧重放视频序列。这允许在击败周期期间观察各个纤毛的精确运动。睫状拍频率(CBF)的十个读数从每个纤毛边缘取自不同区域。
为了评估睫状搏动模式,根据以下评分系统对每个边缘进行评分。正常的前后运动协调的睫状体跳动评分为0。根据沿边缘跳动异常的程度,似乎跳动异常的纤毛评分从1-3分(沿边缘跳动异常的所有纤毛评分为3分)。
CBF直接确定。鉴定了击打纤毛组,并记录完成10个周期所需的帧数。通过简单的计算将其转换为CBF(CBF = 400 /(10次拍摄号码帧)×10)21..
统计分析
每个组的平均值和95%置信区间(CI)计算为测量所有参数的第0天和第3天计算。计算基线的平均变化(第3天0)和95%CIs。不包括0的结果表明第0天和第3天之间的差异,通过配对样品T检验分析。使用Wilcoxon签名等级测试来比较第0天和第3天的动态节拍模式。
未配对的T检验用于将表达的差异分组为来自两组基线的变化即:(第3天第0天)电晕反对(第3天0)假.这被表达为群体和95%CI之间的平均差异。
结果
在接种HCoV的11名志愿者中,有3人没有感冒症状。其中四人确实感冒了,另外四人“可能感冒了”。在出现明确或可能感冒的志愿者中,所有人都有轻微的上呼吸道症状。其中6人出现头痛,4人咳嗽,2人发烧。在确诊感冒的4人中有3人,在可能感冒的4人中有1人的鼻腔分泌物中检测到了病毒RNA。在四名没有感冒症状的志愿者身上没有检测到病毒RNA。接种紫外线灭活病毒的两名受试者出现轻度鼻塞,持续时间小于24小时,从接种后2天开始。本组未报告其他症状。
所有接种活性HCOV的受试者,包括三个没有发展上呼吸道感染的症状,在第3天的呼吸上皮产生了呼吸上皮。与活性病毒接种之前和之后的八个配对样品是从11名志愿者获得的用于透射电子显微镜和睫状函数的比较。
表1⇓总结了细胞类型中所见的变化。与HCOV接种后,纤毛细胞比例显着降低(P <0.05),死细胞比例增加(P <0.05)。在粘液细胞的百分比中没有看到任何变化。
通过定量纤毛损失,细胞投影,细胞质膨胀和线粒体损伤的上皮破坏和损伤全部在第3天显着增加(P <0.05)(表2⇓图。 1a and 1b⇓).
评估睫状体超微结构(表3⇓),在第3天内发现了微尘异常的少量增加(P <0.05)。对于Dynein臂缺陷和睫状体取向之间的第0天和第3天之间没有发现差异。在第0天和第3天的平均CBF之间没有看到显着变化(表3⇓),但纤毛在第3天出现运动障碍(p<0.05)。
从志愿者接种uV灭活病毒的志愿者的样品中没有发生结构或功能的变化(表1-3⇑⇑⇑).比较接种活性HCoV或紫外线灭活病毒的受试者与基线的变化,组间在以下方面有显著差异:纤毛细胞减少,死亡细胞增多,纤毛细胞减少,细胞突起,胞浆起泡,线粒体损伤,微管缺陷和纤毛运动障碍(表1-3)⇑⇑⇑).
讨论
本结果表明,即使在没有明显临床症状的情况下,鼻内接种患有HCOV的鼻接种后会发生重大损害。在接种活性HCOV的所有志愿者中发现了鼻上皮和睫状体上皮和睫状体障碍瘤的破坏证据,即使三个受试者没有寒冷的症状。在虚假感染灭活病毒的受试者中没有看到上皮损伤。假感染后缺乏损伤表明,组织损伤是感染过程的结果,而不是对病毒抗原的免疫介导的反应,或者在接种物中存在的细胞因子的作用,因为它仅在施用活病毒时发生。
尽管上皮分析是盲法的,接种不是盲法或安慰剂对照。然而,鼻腔测量结果表明,该模型是成功的,所有接种者都有明显的上皮损伤证据,大多数人都有感冒的临床症状。选择RT-PCR作为识别HCoV的方法,因为它已被证明比血清学或培养技术更敏感13..回顾过去,血清学和细胞培养可能为感染提供了有用的额外实验室证据。在所有病例中,尽管上皮细胞受损,但RT-PCR结果仅在部分接种者中呈阳性。其原因可能与样品时机、样品质量以及RT-PCR检测中出现假阴性结果的可能性有关。
尽管只有四个志愿者被感染,但发现接种有活性HCOV和假感染受试者的志愿者之间的明确差异。在深入感染的群体中,在接种后3天没有上皮损伤或睫状体障碍症的证据。这表明接种物中的病毒抗原或介质对发现的上皮变化不负责任。似乎具有活性病毒的感染是需要发生上皮损伤的感染。
孟德等等。7.对24种成人志愿者进行的生理测量,其中患有HCOV,其中13个临床症状,八个没有明显的临床症状,但发生了病毒脱落,三个没有感染。鼻气抵抗力和鼻粘膜的温度在有症状和没有症状的情况下增加,这两组均表明肿块炎症。鼻子血液流动在鼻子和鼻粘液分泌中仅增加在有症状的那些中。这些结果与本发现一致,即可能在接种患有HCOV的志愿者中发生炎症过程,该志愿者没有患有寒冷的临床迹象。
公开病毒上呼吸道感染通常延迟鼻粘片清除率5..盲目的上皮和动员没有动达的纤毛缺失可能是这一点的主要因素,但粘液流变的变化也可能是重要的6..在这项研究中,症状的持续时间在第4天达到达到峰值,并在接种后7天解决。本研究仅在接种后3天提供数据。上呼吸道上皮恢复到冠状病毒感染暴露于冠状病毒感染后恢复正常所需的时间。在天然收购的感冒中,上皮恢复到大多数患者的正常情况下3周1,而病毒感染后几周粘液间隙可能是异常的5..
使用数字高速视频系统进行睫毛分析的主要优点是能够在慢动作中发挥睫状体运动,允许它们的节拍频率测量和对其节拍模式的评估。尽管在与HCOV接种后3天在正常范围内记录跳动频率,但观察了患有的疾病纤毛的显着增加。CBF的读数是用纤毛在> 11 Hz的生理温度下进行的。这种高频率意味着通常无法评估动态运动,而不会在慢动作中观察它们。Pedersen.等等。5.研究了自然获得性普通感冒后在22°C条件下的纤毛功能。在这个温度下,纤毛搏动的速度是正常速度的一半,这使得搏动模式的大体变化更容易被察觉。他们还注意到纤毛不同步的显著增加,在感染的头几天是最大的。其他人也发现,在生理温度下测量的CBF在病毒感染后的正常范围内,但他们没有评论是否存在运动障碍。由于快速跳动频率,纤毛运动障碍可能被忽略2.
电子显微镜表现出显着的上皮完整性的损失,并且在冠状病毒接种后纤毛细胞数量非常显着降低。在与其他病毒的鼻感染后已经记录了类似的结果5.那6.那22.那23..
第3天,作者发现外周和中央微管异常有小幅度增加。这比以前报道的儿童自然获得性病毒感染要少3.虽然该研究中没有患者没有冠状病毒感染。在30张培养的培养病毒感染,卡尔森中的22集中等等。3.发现了微管的添加和缺失。在其余的8例中,上皮细胞异常和纤毛细胞的丧失过于严重,使纤毛结构无法评估。拍频或睫状运动障碍的分析没有被探索3..
尽管上皮细胞受损,但电镜下未见病毒粒子。这与其他在普通感冒发作期间对人类鼻腔和支气管上皮进行电子显微镜检查的报告一致1那3.那24.那25..相比之下,有许多已发表的报告体外冠状病毒感染细胞26.-28..afzelius.11.记录了一个2岁的女孩鼻呼吸上皮细胞的单一案例,其2岁的女孩没有常见感冒的症状。这是对排除原发性睫状体障碍诊断的活检的偶然发现。可以在纤毛细胞内部和外部看到病毒粒,但不在粘液细胞内。有些病毒群体位于微绒毛杆附近,在顶端电池膜中的袋中有其他动物,表明微毛虫可能是第一次接触的部位。
病毒感染可造成呼吸道上皮损伤,但无明显临床症状。这可能与肺部疾病有关;例如在慢性化脓性疾病中,在有症状和无症状的病毒感染后肺功能明显下降29..需要进一步的工作来建立对人冠状病毒感染引起的呼吸上皮的病毒损伤的机制。
致谢
作者要感谢莱斯特大学(University of Leicester)统计学高级讲师J.汤普森(J. Thompson)提供的统计建议。作者还感谢莱斯特皇家医院病毒学实验室的支持。
- 收到2000年10月26日。
- 接受2001年6月1日。
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